张晓娟，李旭，栾正刚，马晓春

（中国医科大学附属第一医院重症医学科，沈阳 110001）

脓毒症是指由感染引起的全身炎性反应综合征，其发生率以每年1.5%～8%的速度递增［1］。高迁移率族蛋白 1（high mobility group box 1，HMGB1）是高迁移率族蛋白超家族成员之一，是广泛存在于真核细胞核中最重要的非组蛋白，分子质量小，含量丰富，序列高度保守［2，3］。HMGB1 是脓毒血症晚期重要的炎性介质［4］。血管内皮细胞在脓毒症的发生发展中具有重要作用，当其受到炎性刺激时可释放HMGB1，促进细胞因子和黏附分子的表达［5，6］。HMGB1激活血管内皮细胞的分子机制尚未明确。本研究旨在构建HMGB1基因真核细胞表达载体，并鉴定重组质粒转染到细胞中后HMGB1蛋白的表达，为HMGB1基因在脓毒症发病机制和细胞信号的研究提供有利的分子工具。

1 材料与方法

1.1 菌株、细胞和质粒

人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical venular endothelial cell，HUVEC）株购自南京凯基生物公司，PCDNA-3.1-myc-his-B质粒和大肠杆菌DH5α购自大连TaKaRa公司。

1.2 主要试剂

High-glucose DMEM、胎牛血清购于Hyclone公司；KpnⅠ、EcoRⅠ限制性内切酶﹑T4 ligase DNA连接酶﹑氨苄青霉素100 mg/mL﹑琼脂糖凝胶﹑DL2000 DNA Marker﹑HindⅢ-digest DNA Marker﹑RT-PCR 试剂盒均购自TaKaRa公司；Trizol购自Invitrogen公司；兔抗His标签抗体购自Santa Cruze公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自中杉公司，小提质粒试剂盒、凝胶回收试剂盒购自于爱思进公司。引物合成、DNA测序鉴定由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 载体构建：用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养HUVEC至90%融合，Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA，PCR扩增HMGB1的可读框。用Primer5.0软件设计引物，上游和下游分别引入KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位点，引物序列如下：上游：5′-GGGGTACCATGGGCAAAGGAGATCCTAAGA-3′；下游 ：5′-CGGAATTCGTTTCATCATCATCATCTTCTTC-3′。扩增条件为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 40 s，54 ℃ 40 s，72℃50 s，循环30次。扩增长度为647 bp，将PCR产物和PCDNA-3.1-myc-his-B用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切，电泳后切胶回收。……