马洁华，霍艳丽，罗静娜综述，张 辉审校

（1.河北北方学院基础医学院人体解剖学教研室，河北 张家口075000 2.河北省张家口市妇幼保健院，河北 张家口075000）

皮肤是机体与外界环境接触的屏障，具有抵御外界微生物入侵、代谢、调节体温等重要作用.皮肤缺损的修复是外科领域的一个基本问题，不仅需要创面及时和永久的覆盖而且要能最大限度地恢复功能和外观.目前常用的修复方法—自体皮移植、同种异体皮移植和异种皮移植，都存在着供区不足、免疫排斥和传播疾病等缺陷.因此，寻找一种理想的皮肤替代物成了一个亟需解决的难题［1］.

组织工程是一门新兴的边缘学科，它是利用细胞生物学和工程学原理，研究开发用于修复、维持和改善损伤组织结构和功能的生物替代物的一门学科［2］.组织工程皮肤是将种子细胞与适当的支架材料相结合，构建出用于修复、维护和改善损伤皮肤组织功能和形态的生物替代物.近年来，随着组织工程技术的发展，先后研制出了不同类型的组织工程皮肤替代物［3］，应用组织工程皮肤及时覆盖创面、减少创面收缩、瘢痕增生及恢复外观是解决大面积烧伤皮肤缺损的最根本途径，因而组织工程皮肤的研究临床意义重大.

种子细胞是组织工程的基本要素，因此，种子细胞的选择成为当前组织工程皮肤研究的关键.研究较多的种子细胞主要是自体细胞和干细胞，自体细胞虽然是携带全部基因组型的理想种子细胞，但自体取材损伤大，体外扩增能力有限，对大面积严重皮肤缺损，靠自体取材难以实现皮肤的再生.而干细胞的全能和无限增殖性使其在皮肤组织工程中成为首选，从理论上讲，用单一的干细胞就能够克隆出含多种细胞的复杂的立体的皮肤组织［4］，胚胎干细胞由于具有一定的免疫原性并且受伦理学的限制，目前研究倾向于成体干细胞.现在骨髓干细胞 （bone marrow stem cells，BMSCs）的体外诱导技术较为成熟，但其来源少、数量有限［5］，限制了其广泛应用.自从2001年Zhk［6－7］等从脂肪抽吸物中成功分离出脂肪干细胞 （adipose derived stem cell，ADSCs）以来，ADSCs的研究成为继BMSCs之后又一热点.ADSCs具有来源丰富、方便取材、低免疫原性、体外扩增条件低等优点，它将成为今后组织工程皮肤理想的种子细胞.现就ADSCs的分离、识别及其研究进展作一综述.

1 ADSCs的概念和来源

Zuk等［6－7］以吸脂方式获得的人脂肪组织为研究对象，按照Katz等［8］的干细胞分离方法，消化离心后简单处理脂肪组织，获得一个显微镜下呈成纤维细胞形态的细胞群，体外培养过程中发现该细胞群具有稳定的倍增效应和低衰老性，与BMSCs相似，因此称之为ADSCs.ADSCs与BMSCs的细胞生长动力学、细胞衰老、多向分化能力以及基因转染效率无显著差异，但ADSCs原代培养中红细胞参杂比例不会随着组织量的增加而大幅增加［9］.管利东［10－11］等证实了ADSCs在不同诱导方案下能够分化为脂肪细胞、肝细胞、成骨细胞、内皮细胞、骨骼肌和心肌细胞、神经样细胞、软骨细胞及造血细胞等组织细胞［12－18］.

提取ADSCs的脂肪组织主要来源于外科手术切取和抽脂术废弃的脂肪，从脂肪组织中分离细胞的方法最早由Rodbell报道，Zuk等［6－7］实验证实了ADSCs的存在.对如何获得纯度高、增殖活性强的ADSCs，研究者在年龄、取材部位、培养条件和传代次数等方面做了大量研究，Schipper等［19］发现ADSCs在人前臂脂肪组织中含量更多.目前微载体技术和旋转生物反应器的联合应用为ADSCs的大规模扩增提供了更加有效的途径［20－21］.

2 ADSCs的生物学特性及鉴定

2.1 ADSCs的形态

原代培养ADSCs接种时，培养物中混有大量红细胞，随着换液次数的增多红细胞被清除.接种后24 h内基本完成贴壁，72 h后细胞完全伸展，贴壁细胞开始分裂增殖，呈两种形态：一种为梭形成纤维细胞样，两端有较长的突足；另一种为扁平不规则或多角形，突起较大.1周后细胞融合，排列出现方向性，呈 “漩涡状”.传代后细胞呈克隆样生长，以梭形细胞为主.电镜观察显示，ADSCs早期呈成纤维细胞样，胞核大，含有丰富的内质网.

2.2 ADSCs的分离

目前应用最广泛的ADSCs分离纯化方法是胶原酶消化法［22－23］.利用分子表型进行分离比较困难，因为ADSCs无特异性的分子标志.目前，ADSCs分离纯化的另一个新线索是通过免疫化学方法检测ADSCs中的CD44、HLA－DR和Ⅷ因子.ADSCs的获得量和分化能力受一些因素影响，如取材部位、年龄等.通常供者年龄越小，ADSCs的增殖能力越强，腹部脂肪获得的ADSCs不易凋亡［24－25］，脂肪抽吸术一般不影响ADSCs的活性，但超声辅助条件下获得的ADSCs增殖能力降低［26］.

2.3 ADSCs的表型及鉴别

目前尚无简便快速鉴定ADSCs的方法，ADSCs在形态上与BMSCs相似，因此无法从形态学上与之鉴别［27］.ADSCs与BMSCs共同表达CD29、CD44、CD71、CD90、CD105等，但前者表达CD49d，不表达CD106，而后者恰恰相反［28］.对ADSCs免疫表型的鉴定研究者做了大量工作，但结果却不尽相同.如Gr ont hos等发现ADSCs表达CD34，不表达STRO－1，而Likewise和Zuk则得到相反的结果［29－30］，这可能与检测所用的细胞代数、分离方法及使用的单克隆抗体不同等有关.干细胞与分化成熟细胞的不同之处在于细胞表面抗原表达不同，更重要的是前者具有多向分化的能力.因此鉴定ADSCs最好的方法是进行多系定向诱导，免疫组化染色和流式细胞仪检测免疫表型的结果可起辅助作用.现在大多数试验研究中鉴定ADSCs常运用流式细胞仪检测其中的CD49d、CD44、CD106.

3 ADSCs向表皮细胞分化的研究

目前文献报道的ADSCs体外诱导向表皮细胞分化的研究报道还很少［31］.当前运用较多的方案是条件培养基加表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子 （basic fibroblast growth factor，b FGF）或者HaCa T细胞，鉴定上大多数实验通过检测CK19以及CK5／8、CK1、CK10／13来证实诱导培养物为表皮细胞.雷永红等［31］用含30%大鼠皮肤匀浆液的条件培养基培养ADSCs，3 d后流式细胞仪检测ADSCs表达CK19、CK14的阳性率较对照组明显升高.Martin等［32］用全反式维甲酸 （ATRA）、地塞米松、ITS、尼克酰胺、牛血清白蛋白、葡萄糖鸟氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺等作为条件培养基成功诱导ADSCs向表皮细胞分化.王先成等［33］在有EGF及维甲酸等成分的诱导培养基下，使ADSCs转化为类角质细胞.Thomas［34］等将ADSCs在流式细胞仪中分选纯化并标记，注入皮肤缺损的裸鼠体内，1周后在皮肤原缺损处可检测到标记的ADSCs，表明ADSCs在体内可向表皮细胞转化.以上结果提示，ADSCs在特定的诱导条件下有早期向表皮细胞表型转分化的潜能［35－36］.

4 ADSCs促进创面愈合的研究

ADSCs可通过分泌多种生长因子，如VEGF、PLGF、TGF－β和HGF等，以促进创伤部位血管再生及重建［37］；还能通过旁分泌作用于成纤维细胞，使其分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原和纤连蛋白，促进皮肤表皮细胞的成熟［38］，从而促进创面愈合和瘢痕缩小.

5 结 语

随着对ADSCs认识的深入，促进、支持其生长分化成熟的各种生物因子，模拟体内微环境的细胞外基质等研究均将取得重大突破，为ADSCs成为组织工程皮肤研究的理想种子细胞，并最终用于以细胞为基础的临床治疗提供前提和保障.为临床上解决严重创伤、大面积烧伤病人的皮肤来源紧张问题和促进难愈创面的修复等问题提供良好的解决方法.

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