赵恭文 李长松 李 林 张 博 刘建军 齐军山*

（1山东师范大学生命科学学院，山东济南 250014；2山东省农业科学院植物保护研究所，山东省植物病毒学重点实验室，山东济南 250100；3山东省食品发酵工业研究设计院，山东济南 250013）

植物是生物活性化合物的天然宝库，其产生的次生代谢物质超过40万种，其中许多次生代谢物质具有杀虫或抑菌等生物活性，在农业、医药上具有重要的价值（Swant，1977）。利用植物资源对农业病害进行防治，具有资源丰富、环境友好、低毒、不易产生抗药性等优势。Gould（1989）就曾报道了1 389种植物可以作为杀菌剂，其中包含的抗毒素、类黄酮和酚类等不同类型的化合物均具有杀菌或抗菌活性。孟昭礼和罗兰（1998）从银杏中分离出对植物病原菌有高活性的化合物，经结构鉴定、人工模拟合成，成功开发出绿帝系列农用杀菌剂。Gautam等（2001）发现三叶鬼针草（Bidens pilosa）提取物对野油菜黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas campestrispv.oryzae）、菊欧文氏菌玉米致病亚种（Erwiniachrysanthemipv.zeae）两种细菌具有抑制作用，其中对野油菜黄单胞菌水稻致病变种的抑制作用更明显。de Boer等（2005）发现6种非洲植物Coccinia adoensis，Cineraria grandiflora，Pavonia urens，Marattia fraxinea，Clutia abyssinicavar.usambarica和Vangueria infausta的乙酸乙酯、甲醇、冷水和沸水提取物对白假丝酵母（Candida albicans）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、黄色镰孢菌（FusariuMculmorum）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、丁香假单孢菌（Pseudomonas syringaepv.syringae）和解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）均有抑菌活性。

我国药用植物资源十分丰富，明朝的《本草纲目》记载了1 892种药物，其中植物1 095种。《中国土农药志》（中国土农药志编辑委员会，1959）收录土农药522种，其中包括植物性土农药403种。《中国有毒植物》（陈冀胜和郑硕，1987）记载我国有毒植物 943种，有不少具有杀虫抑菌活性。《中药大辞典》（南京中医药大学，2006）收载药物6 008味，其中大多为植物药，且许多植物都具有杀菌功能（周志权 等，2001）。虽然药用植物种类繁多，但只有极少部分做了抗菌、杀菌活性研究（严振 等，2005）。对有杀菌活性植物进行筛选是开发植物源杀菌剂的前提和基础，而鉴定、改造其中的杀菌成分是开展杀菌植物研究的重要方向。本试验选择28种药用植物并对其杀菌活性进行筛选，旨在为分离鉴定植物源农药先导化合物提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试真菌

供试真菌瓜果腐霉（PythiuMaphanidermatum）和尖镰孢菌（FusariuMoxysporium）分离自西瓜，茄镰孢菌（FusariuMsolani）和灰葡萄孢（Botrytis cinerea）分离自番茄，辣椒疫霉（Phytophthora capsici）分离自辣椒，禾谷镰孢菌（FusariuMgraminearum）分离自小麦。所有病原真菌均由山东省农业科学院植物保护研究所分离纯化、鉴定后保存。

灰葡萄孢分生孢子收集参照Doehlemann等（2005）的方法并稍加改进。将灰葡萄孢接种于PSA培养基上，22 ℃恒温培养6 d后，再经紫外灯诱导，通风放置1～2 d，以无菌水轻轻洗脱孢子，过滤，1 000 r·min-1离心5 min，去上清液，加无菌水，再离心。最后用无菌水重悬至孢子浓度为1×105～1×107个·mL-1，并加入葡萄糖溶液至浓度为0.5%。

1.2 供试药用植物

供试药用植物共28种（表1），均购于济南市建联中药店。分别阴干，粉碎，过20目筛。每种药用植物称取50 g干粉，用丙酮室温下浸提3次，每次用150 mL丙酮浸提24 h。每次过滤前超声波处理2次，每次15 min。过滤，合并滤液。用旋转蒸发仪浓缩并定容至50 mL备用。

1.3 抑菌活性测定

1.3.1 菌丝生长法 每种药用植物提取液用0.22 μL针头式细菌滤器过滤后取2.4 ML，加入45 mL PDA培养基中混匀（每亳升培养基中含有50 mg植物干粉），倒入直径90 mm培养皿中，倒3皿。选择事先培养好的生长均匀的菌落沿其边沿用打孔器打直径5 mm的菌饼，待培养基凝固后接种菌饼于中心。对照加2.4 ML的丙酮代替药用植物提取液。瓜果腐霉19 ℃培养2～3 d，辣椒疫霉30 ℃培养7～8 d，尖镰孢菌和茄镰孢菌25 ℃培养6～7 d，灰葡萄孢21 ℃培养6～7 d，禾谷镰孢菌27 ℃培养5～6 d，待对照快要长满培养皿时用十字交叉法测量菌落直径，取平均值。计算抑制率，3次重复（陈年春，1991）。

1.3.2 孢子萌发法 把抑制菌丝生长效果较好的 5种药用植物提取液旋蒸浓缩成浸膏，分别称取1 mg，加入20 μL丙酮溶解，再用980 μL的0.1%吐温80水溶液稀释，各提取液均配成浓度为1 mg·ML-1的药液。将各药液依次吸取0.5 mL加入到不同的小试管中，然后吸取制备好的孢子悬浮液0.5 mL，分别使药液与孢子悬浮液等量混合均匀。吸取上述混合液滴到凹玻片上，保湿适温培养。每处理3次重复，并设不含药液的空白对照。待空白对照分生孢子萌发率达到90%以上时，检查各处理分生孢子萌发情况，计算分生孢子萌发相对抑制率（NY/T 1156.1—2006）。

2 结果与分析

2.1 28种药用植物提取液对6种植物病原真菌菌丝生长的抑制作用

供试的28种药用植物提取液对6种常见植物病原真菌菌丝生长的抑制率见表1。有17种药用植物提取液至少对1种病原真菌的菌丝生长抑制率在70%以上，占供试植物的60.71%。其中对供试的6种病原真菌抑制效果都比较好的为丁香；对5种病原真菌抑制效果较好的有乌梅、百部和木香；桂枝对瓜果腐霉、辣椒疫霉、灰葡萄孢和禾谷镰孢菌等 4种病原真菌的抑制效果较好；黄岑对3种病原真菌抑制效果较好；漏芦和猪牙皂对2种病原真菌抑制效果较好；对其中 1种病原真菌抑制效果较好的有槟榔、苦参、黄柏、川楝子、射干、白蔹、地肤子、菊花、虎杖。

表1 28种药用植物提取液对6种植物病原真菌的菌丝生长抑制率

丁香、乌梅、百部、木香、桂枝等几种药用植物提取液抑菌谱广且抑菌率高，说明其中含有广谱杀菌的活性物质，值得进一步研究其中的活性成分。

2.2 5种药用植物提取液对灰葡萄孢分生孢子萌发的抑制作用

杀菌活性较好的 5种药用植物丁香、乌梅、百部、木香和桂枝提取液对灰葡萄孢的分生孢子萌发都具有较好的抑制作用（表 2），这 5种药用植物提取液对灰葡萄孢分生孢子萌发相对抑制率均在90%以上，进一步验证了这5种药用植物的杀菌活性，值得进一步研究其杀菌成分。

表2 5种药用植物提取液对灰葡萄孢分生孢子萌发的抑制作用

3 结论与讨论

本试验采用菌丝生长法和孢子萌发法两种方法都证明丁香、乌梅、百部、木香和桂枝具有较好的杀菌活性，特别是丁香抑菌活性高、抑菌谱广。中药丁香是桃金娘科植物丁香的干燥花蕾。丁香对多种霉菌和致腐菌的生长繁殖有抑制作用（周建新 等，2003；蒋志国和施瑞城，2006）。丁香中的抑菌成分有丁香酚、乙酰丁香酚、丁香烯、水杨酸甲酯、甲基正戊基酮、苯甲醛、乙酸苄酯等。丁香酚是丁香中的重要成分，占丁香油的70%～85%（南京中医药大学，2006）。近年来研究发现，丁香具有抗微生物、麻醉止痛、抗凝血、解热降温、保肝利胆和祛蚊等多种生物活性，而这些功效与丁香酚有着密切关系（邱电 等，2007）。

植物精油是植物体内分子量较小，可随水蒸气蒸出，具有一定气味的天然挥发性油状液体物质。植物精油具有广泛的抑菌、杀虫、抗氧化等活性，在医药、农业、饲料添加剂和食品防腐保鲜等方面有广泛应用（刘学文 等，2004；孙伟 等，2004；疏秀林 等，2006；张克英，2006；刘芳 等，2008）。本试验筛选出的这几种抑制植物病原真菌生长的药用植物，其活性成分很可能在精油部分，有必要对其杀菌成分进一步分离鉴定。

以植物丙酮提取液为材料筛选具有抑菌活性的植物很难完全反映植物体内的真实情况，甚至会漏筛。原因如下:第一，植物材料只取其药用部分，并非全株；第二，植物干燥后，强挥发性的杀菌成分可能会散失；第三，选取丙酮为溶剂是因为其对病原菌毒性较小，但其提取能力未必最高，难以将极性和非极性的物质都抽提出来；第四，测定抑菌活性选用粗提物，若杀菌成分含量低时未必检出活性；第五，有些成分离体时抑菌活性很低，但在活体上抑菌活性很强。本试验筛选出的抑菌活性较好的药用植物的杀菌谱及其杀菌成分和作用机理均有必要进一步研究。

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