王爱杰 章 云 刘 洋 冯 辉

（沈阳农业大学园艺学院，辽宁省十字花科蔬菜遗传育种重点实验室，辽宁沈阳 110866）

小孢子培养是创制双单倍体的有效手段。自德国学者 Lichter（1982）首次报道甘蓝型油菜（Brassica napus）游离小孢子培养成功后，小孢子培养在结球甘蓝、大白菜、花椰菜、普通白菜（小白菜）、黑芥、叶芥、青花菜、萝卜等十字花科蔬菜作物上获得了成功（Miyasaka et al.，1989；张凤兰 等，1994；王蒂 等，1996）。但是，对于一些特殊基因型材料如耐抽薹大白菜和耐抽薹普通白菜的小孢子培养仍然存在着胚诱导率低和成苗难等问题。

培养基是影响小孢子培养成功与否的关键因素（Ferrie et al.，2005）。徐艳辉等（2001）研究表明，NLN-13液体培养基中添加0.20 mg·L-1的BA对大白菜小孢子胚发生有明显的促进作用。韩阳等（2006）研究认为，培养基中添加 0.10～1.00 mg·L-1的 NAA对大白菜小孢子胚的发生有抑制作用，且浓度越高抑制作用越大；2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）对小孢子胚的发生也有较强的抑制作用；细胞分裂素在较低浓度时能促进胚状体发生，较高浓度则抑制胚状体发生，用ZT诱胚的适宜浓度为0.20 mg·L-1，用6-BA（6-苄氨基嘌呤）诱胚的适宜浓度为0.40 mg·L-1。路翠玲等（2004）报道，在NLN-13液体培养基中添加谷氨酰胺、谷胱甘肽和L-丝氨酸可明显促进小孢子胚状体形成。Zhang等（2011）研究表明，在 NLN-13液体培养基中添加PCIB（对氯苯氧异丁酸）对大白菜小孢子胚状体形成和直接成苗有明显促进作用。

Letarte等（2006）研究发现，阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan，AG）和阿拉伯半乳糖蛋白（arabinogalactan-proteins，AGPs）对小麦（TriticuMaestivuML.）小孢子培养胚发生和直接成苗有促进作用。AG是一类长的、高度支链的由阿拉伯糖与半乳糖组成的中性多糖（Hauer &Anderer，1993）。缪平等（1994）对罂粟花粉中AG的结构进行了研究，发现AG是由等量的阿拉伯糖和半乳聚糖组成。Günter和Ovodoy（2002）研究证明，麦瓶草（Silene vulgaris）愈伤组织中的AG具有免疫调控活性。AGPs是一类异质性的糖蛋白，在植物的根、茎、叶、花和种子中均可发现，主要由蛋白质和碳水化合物（糖类）组成，其蛋白质部分的含量不超过 10%，富含羟脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，氨基酸含量和种类因物种和组织的不同而有变化。Kreuger和van Holst（1993）发现从胡萝卜（Daucus carotaL.）种子中提取出的AGPs、或者从胡萝卜胚性悬浮细胞培养物中提取出来的AGPs可以恢复非胚性细胞的胚性状态。在拟南芥细胞培养（Gao & Showalter，1999）和烟草BY-2细胞悬浮培养（Chaves et al.，2002）中，AGPs可能与细胞程序性死亡相关。从结构上说，AG是与 AGPs中的阿拉伯半乳糖类似的物质，但与 AGPs相比，AG中没有蛋白质成分（Clarke et al.，1979）。

本试验以3个耐抽薹大白菜〔Brassica campestrisL. ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕和3个耐抽薹普通白菜（小白菜）〔B.campestrisL. ssp.chinensis（L.）Makino var.communisTsen et Lee〕一代杂种为试材，在NLN培养基中加入一定浓度的AG和AGPs，探讨AG和AGPs对大白菜和普通白菜小孢子胚状体诱导和成苗的影响，以优化小孢子培养技术体系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2010年9月开始在辽宁省十字花科蔬菜遗传育种重点实验室进行。供试材料为3个耐抽薹普通白菜一代杂种:引自日本的冬赏味、先正达种子（北京）有限公司的博雅和国家蔬菜工程技术研究中心育成的京冠2号；以及3个耐抽薹大白菜一代杂种:引自韩国的金贝贝、黄心202和新理想。分3期播种，第1期于8月下旬将萌动的种子在4 ℃冰箱中春化处理，大白菜春化处理30 d，普通白菜春化处理25 d。春化处理后的种子播于50孔穴盘，当幼苗长至5片真叶时定植于温室花盆中，12月中旬～翌年3月开花取样。第2期和第3期试材各延迟30 d播种。

试验所使用的AG｛分子式:〔（C5H8O4）（C6H10O5）6〕X｝购于东京任成工业株式会社，AGPs（商品名:阿拉伯树胶粉）购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 小孢子分离与培养

小孢子分离纯化和悬浮培养参照栗根义等（1993）和姜凤英（2006）的方法。开花期采集健壮植株上花瓣长度与花药长度比值在0.50～0.75之间的花蕾（小孢子发育处于单核靠边期至双核早期），每20个花蕾为1组，流水冲洗3次，经70%乙醇溶液表面消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液消毒8 min，无菌水洗涤3次，每次5 min。沥干水分后，在B5液体洗涤培养基中用玻璃棒碾压花蕾，挤出小孢子。小孢子悬浮液经孔径50 µm的尼龙网过滤后，收集于10 mL离心管中，1 000 r·min-1下离心3 min，弃上清液，重复2次，所得沉淀物即为纯净小孢子。

将分离纯化后的小孢子用添加0、5、10、20、40 mg·L-1AG和0、10、100 mg·L-1AGPs的 NLN-13培养基进行悬浮，用血球计数板计数，调整小孢子浓度为 1×105个·ML-1。随后用直径60 mm的培养皿分装，每皿5 ML，Parafilm膜封口。33 ℃条件下暗培养24 h后，转至25 ℃下暗培养，待肉眼可见胚状体时转移到50 r·min-1摇床上继续进行暗培养，21 d后统计胚状体数目，并转入MS培养基（添加30 g·L-1蔗糖和5.5 g·L-1琼脂）中进行继代培养；21 d后统计直接成苗率、绿色组织率、愈伤率、褐化率和死亡率。

1.3 数据分析

采用SPSS 统计软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 AG对小孢子胚状体诱导的影响

由表1可知，在NLN-13培养基中加入一定浓度的AG，对小孢子胚状体诱导有显著影响。当AG达到10 mg·L-1时，供试品种的小孢子胚状体诱导率最高，其中普通白菜冬赏味胚诱导率达到6.33胚·蕾-1，大白菜新理想达到7.67胚·蕾-1。

2.2 AGPs对小孢子胚状体诱导的影响

由表2可以看出，AGPs对耐抽薹大白菜和普通白菜小孢子胚诱导有明显的促进作用。随着培养基中AGPs浓度的增加，胚诱导率呈现先升高后降低的趋势，在 AGPs浓度为 10 mg·L-1时，胚诱导率达到最高，其中普通白菜博雅胚诱导率达到5.53胚·蕾-1，大白菜新理想达到8.40胚·蕾-1。

表1 NLN-13培养基中添加AG对大白菜和普通白菜小孢子培养胚状体诱导的影响

表2 NLN-13培养基中添加AGPs对大白菜和普通白菜小孢子胚状体诱导的影响

2.3 培养基中同时添加AG和AGPs对小孢子胚状体诱导的影响

在NLN-13培养基中同时添加10 mg·L-1AG和10 mg·L-1AGPs，对小孢子胚诱导有更大的促进作用，普通白菜冬赏味、博雅和京冠2号的胚诱导率分别为8.33、9.20胚·蕾-1和8.47胚·蕾-1，大白菜金贝贝、黄心202和新理想的胚诱导率分别为12.13、8.67胚·蕾-1和10.60胚·蕾-1，比单独添加AG或AGP的处理胚诱导率增加了1倍左右。

2.4 AG和AGPs对小孢子胚状体发育的影响

由表 3可知，在 NLN-13培养基中分别加入 10 mg·L-1AG、10 mg·L-1AGPs和 10 mg·L-1AG+10 mg·L-1AGPs，对大白菜及普通白菜胚状体发育成苗均有一定的促进作用，其中同时添加10 mg·L-1AG和10 mg·L-1AGPs的作用最大，可使供试品种的胚状体终成苗率比不添加AG、AGPs处理提高1倍左右，达到80%以上；直接成苗率比不添加AG、AGPs的处理提高4～6倍，达到40%以上。添加AG、AGPs和AG+AGPs处理的胚状体褐化率和死亡率明显减少。

表3 AG和AGPs对大白菜和普通白菜小孢子胚状体发育和成苗的影响

3 结论与讨论

如何提高胚状体诱导率是建立高效的游离小孢子培养体系的关键问题，在这方面前人已经做过许多探索。Baillie等（1992）对不同基因型的大白菜小孢子培养发现，初始接种采用蔗糖浓度为17%的NLN培养基，48 h后更换到蔗糖浓度为10%的培养基中，可以使胚状体诱导率提高，但是这种方法操作繁琐，容易造成污染。外源激素对小孢子胚状体形成和植株再生的影响至今也没有取得一致的结果，徐艳辉和张凯（2000）认为，培养基中添加0.2 mg·L-1BA可使大白菜小孢子胚诱导率显著提高，但对难以成胚基因型材料的作用不大；张亚丽等（2009）对耐抽薹大白菜品系05BRF1-20、05BRF1-22和晚熟品种秦白3号进行游离小孢子培养，没有诱导出胚。本试验添加AG和AGPs均可提高小孢子胚状体诱导率，操作简便，在一定程度上可以解决难出胚基因型材料的胚状体诱导问题，但是本试验所采用的材料有限，并不能代表所有难出胚基因型材料，所以针对其他难出胚基因型材料还需要进一步验证。

本试验结果表明，AG和AGPs对大白菜和普通白菜胚状体的发育均有促进作用，显著提高胚状体直接成苗率，降低胚状体的褐化率和死亡率，这与Letarte等（2006）在小麦小孢子培养上的试验结果是一致的。van Hengel等（2001）研究发现，从培养基或未成熟的胡萝卜种子中提取出来的AGPs可全部恢复甚至提高体细胞胚发生能力。Egertsdotter和Vonarnold（1995）发现，从挪威云杉（Picea abies）种子中提取的 AGPs可以促进挪威云杉悬浮细胞的体细胞胚发育。Kreuger等（1995）研究证明，从胡萝卜种子中获得的AGPs可以促进仙客来（Daucus carotaL.）胚性细胞团的增加。本试验研究发现，在培养基中加入AG和AGPs促进大白菜和普通白菜小孢子胚状体发生及直接成苗的作用没有品种特异性。

在大白菜和普通白菜小孢子培养过程中，在培养基中添加10 mg·L-1AG、10 mg·L-1AGPs或10 mg·L-1AG+10 mg·L-1APGs，有利于胚性细胞的发生和发育，降低小孢子胚状体的死亡率，促进胚状体向着直接成苗的方向发展。其作用机制可能与AG和AGPs的多糖部分结构有关，也可能与AGPs的蛋白成分有关，其机理尚需进一步研究。

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