张保强 张晓

液态芯片是美国纳斯达克上市公司Luminex于本世纪初研制出的后基因组时代的技术平台，又称悬浮阵列、流式荧光技术，是基于多功能流式点阵仪 （Luminex 100）开发的多功能生物芯片平台，是一个多功能、多指标并行分析系统（见图1）。它有机地整和了编码微球（color-codedbeads）、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，造就了高度的检测特异性和灵敏度，可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，也是目前唯一得到权威机构和医学界共同认可用于临床诊断的生物芯片平台。2003年美国食品与药品管理局(FDA)批准该项技术用于临床检验诊断。

图1 Luminex 100 多功能流式点阵仪

1 Luminex液态芯片技术的概况

1.1 工作原理

该技术的核心是采用聚苯乙烯(polystyrene)制作微球，把微小的聚苯乙烯小球（5.6 μm）包覆以不同比例的红光及红外光染色剂，制成100种不同颜色的微球[1]（见图2）。将每种颜色的微球（或称为荧光编码微球）共价交联上针对特定检测物的探针、抗原或抗体。不同的微球结合了针对不同待检测物的蛋白（抗体或抗原，用于免疫检测）或核酸（DNA或RNA用于基因检测），检测抗体中以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。应用时，先把针对不同检测物的编码微球混合，再加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的分子进行特异性地结合，在一个反应孔内可以同时完成多达100种不同的生物学反应。

检测时，使单个的微球通过检测通道,并使用双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测（见图3）。红色激光激发的是微球上的红色分类荧光，根据微球的不同色彩编号，可以将微球分类，从而将各个不同的分析反应区分开来（见图4）。绿色激光激发的是绿色报告荧光分子，目的是确定微球上结合的报告荧光分子的数量，从而确定微球上结合的目的分子的数量（见图5）。因此，通过红绿双色激光的同时检测，可以确定被结合的检测物的种类和数量。再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微珠种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物的浓度。因为分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，而且可以在一个微量液态反应体系中同时检测多达100个指标。

图2 不同浓度的两种颜色：红色和红外10种比例可以对100种微球进行编码

图3 利用红绿双色荧光对微求进行检测

图4 红色激光激发微球的标码荧光（定性）

图5 绿色激光激发二抗标记的荧光（定量）

1.2 技术特点

Luminex液相芯片技术具有三大核心优势：①高通量，一次操作可以检测100个指标；②既能检测蛋白，又能检测核酸；③既能用于临床，用能用于科研。此外，该技术还具有需样本量少（检测需样本量仅为10μl）、高速度（最快可达10000测试/h）、灵敏度高（检测低限为10pg/ml）、线性范围广（检测范围可达6个数量级）、重复性好、成本低、操作方便（见图6）、数字信号、客观可靠（见图7）等优点。

图6 Luminex 100™多功能流式点阵仪工作流程

图7 标准曲线

2 Luminex液态芯片技术在临床中的应用

2.1 肿瘤标志物检测应用

肿瘤标志物检测在肿瘤的早期诊断、疗效检测、预后评价、肿瘤复发的早期发现及高危人群的筛查等方面有着广泛的应用。现常用的肿瘤标志物检测方法有酶免疫分析法、时间分辨荧光法、化学发光法、电化学发光法、液态芯片法等。由于大部分单个标志物敏感性或特异性偏低，不能满足临床需要，近十年来，理论上和实践上都提倡一次同时测定多个标志物。肿瘤标志物联合应用可提高检测的敏感性。多肿瘤标志物液态芯片定量检测方法即是顺应该要求,利用液态芯片的原理和特点建立的一种新型肿瘤标志物检测方法。液态芯片技术检测肿瘤标志物，在一次可检测的指标数、标本用量、检测速度、重复性、减少试剂成本、平台通用性等方面，有其明显的优势。

2.2 自身免疫性抗体检测的应用

自身抗体泛指机体免疫系统受某些内因、外因的作用对自身正常或变性的组织、器官、细胞、蛋白质或酶类等自身抗原成分产生免疫应答，由机体B淋巴细胞产生针对自身成分的抗体。自身抗体是自身免疫性疾病的重要标志，每种自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗体谱。病人血液中存在高效价自身抗体是自身免疫病的特点之一，也是临床确诊自身免疫性疾病的重要依据，对其进行综合检测分析在确诊及预后评估具有重要意义。

常用的自身抗体检测方法有微孔板ELISA法、免疫印迹法、酶免疫斑点（条带）试验等。传统的检测自身抗体的方法都存在手工操作、检测费时、需样本量大等缺点。近几年发展起来的液态芯片技术采用在微球表面的双抗夹心法检测自身抗体，可多指标并行检测，其检测速度、自动化程度等均高于传统方法。Rouquette 等利用液态芯片技术对九种抗核抗体（dsDNA,SSA,SSB,Sm,Sm/RNP,Scl-70,Jo-1,ribosome,and centromere B）进行检测，此技术的灵敏度为99.1%，特异性达到100%。

目前，国际上有BMD、Bio－Rad Diagnostics、INOVA Diagnostics、ZEUS Scientific基于液态芯片平台开发自身免疫疾病诊断方面的产品。其中2001年7月27日，INOVA公司的ENA系列液态芯片产品率先通过美国FDA认证，成为首个得到美国FDA认证的液态芯片产品。

2.3 移植配型的应用

临床开展的HLA分型是针对等位基因A、B、DR三个位点六个抗原的分析。传统的血清学分型法由于其特异性、分辨率等方面的不足，已经逐渐为分子生物学方法所替代，现HLA分型实验室多采用PCR-SSP及PCR-SSO分型法。PCR/SSP方法用设计出的一整套等位基因组特异性引物，借助PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，通过电泳直接分析带型决定HLA型别，但不易自动化、不能检测新的等位基因、试剂盒需不断升级。Luminex液态芯片技术进行HLA分型，是把针对不同HLA等位基因特异性的探针与微珠结合，然后与扩增的DNA在一个实验管里面进行杂交，以流式的原理进行检测，这种技术在满足有高通量、高灵敏度的同时，特异的探针技术能够使得同一条链上的多态性位点建立一种关联（即单倍型分析），进一步提高了分型的特异性。Luminex液态芯片技术的PCR-SSO分型法已经成为国家骨髓库HLA分型的主要手段。

3 Luminex液态芯片技术在科研中的应用

3.1 Luminex XMAP液态芯片技术检测人乳头瘤病毒基因型

据世界卫生组织国际癌症研究中心( International Agency for Research on Cancer, IARC)统计，宫颈癌是第二大女性恶性肿瘤。人乳头瘤病毒（HPV）是宫颈癌及其癌前病变发生发展的必要条，其亚型众多，依其致病能力不同分为高危型和低危型。HPV检测已成为宫颈癌筛查的重要方法之一，基因芯片技术检测与分型同时进行，是目前HPV基因型研究的主要技术。上海透景生命科技有限公司研制的HPV DAN分型检测液态芯片，可同时检测26种HPV亚型，一次呈现，并具有以下优点：①明确分型，直接以亚型出具报告；②且反应灵敏度高，检测低限仅为6-10拷贝；③杂交反应只需要15 min；④无需洗涤，操作简便；⑤激光分析，数字信号，结果客观、可靠；⑥可96孔板操作，适用于大规模筛查。

3.2 细胞因子检测的应用

细胞因子(cytokine，CK)是由细胞（免疫细胞、非免疫细胞）合成、分泌的具有生物活性的低分子量蛋白质或多肽的统称。细胞因子检测在分子生物学基础研究、揭示某些疾病的发生发展机制以及诊断和治疗中具有重要的应用价值。对细胞因子水平进行全面监测与评价比监测单个细胞因子更具有临床意义，但目前的检测方法（分子生物学法、免疫法和生物学测定法）每次只能单一检测一种细胞因子,且存在相互干扰、灵敏度不高、测定结果变异大、操作繁琐、费时等问题。

应用液态芯片技术，可以检测白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等各种细胞因子。Tarnok等运用液态芯片技术检测六种促炎性细胞因子(IL-1β、6、8、10、12、TNF-α)，用于新生儿脓毒血症早期诊断。与传统的检测方法ELISA对比，二者的检测结果具有良好的相关性，但液态芯片在孵育时间、标本用量、检测线性范围、检测低限等方面均优于ELISA法，解决了传统检测方法费时、成本高及样本采样量大等缺点。Ray CA等在血浆中同时检测5种细胞因子（IL-1-β,TNF-α,IL-6,IL-8,and IL-10），IL-8检测最低限是100pg/ml，其它检测最低限是20pg/ml，与ELISA相比，结果吻合度为84.5%，但比ELISA少用80%的样本量，实验更经济。

3.3 在microRNA表达谱分析中的应用

MicroRNA是一种非编码的短链RNA序列，它们在多种生物学过程中起着关键作用，部分肿瘤中已经发现了miRNA的表达异常，但miRNA的表达在肿瘤诊断中的价值尚未有过系统的研究。由于miRNA的序列很短（大约21bp），且不同序列家族之间的相似性非常高，现有方法用于miRNA研究时存在严重的交叉反应，因此需要一种准确、经济的新方法。有研究利用液芯技术对334个包括多种人类肿瘤标本的217个哺乳动物miRNA的表达谱进行了系统研究，结果表明miRNA表达谱能够反映肿瘤的组织来源和分化状态，还发现肿瘤组织中的miRNA表达普遍下调。研究还发现，通过分析miRNA表达谱，可以成功地对分化程度很差的肿瘤进行分类，而mRNA的表达谱在应用于同一个样本时的准确性极低。这些结果表明miRNA表达谱分析在肿瘤诊断中有着重要的应用价值。液态芯片技术用于microRNA表达谱分析，不但准确型高、特异性好，而且可以方便地用做常规检查。

3.4 传染病的诊断

目前，国外有报道通过将病原体的诊断抗原或变态反应原固定在微球表面上，实现对多种传染性疾病如艾滋病（HIV）、麻疹、单纯疱疹、流行性腮腺炎等进行快速诊断[2-3]。

液态芯片是较为理想的的临床应用型生物芯片，是唯一得到美国FDA批准的芯片类技术[4]，也是唯一被纳入美国临床实验室质控网络的诊断芯片。作为近几年来发展起来的新技术，液态芯片在肿瘤标志物检测、自身抗体检测、HLA分型、HPV基因分型、细胞因子、传染病检测等方面有了广泛的应用。但此技术目前仍有不成熟之处，在缩小微球的球粒，使反应体系更接近液相环境；降低多指标检测时不同抗体间或抗体与样品蛋白之间可能存在的相互影响等方面还需要不断改进。但可预见，液态芯片技术作为生物信息学先进的操作技术平台,必将在临床和科研各方面有着广阔的应用前景。

[1]Biagini RE，Sammons DL，Smith JP，et a1.Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins[J].Clin Diagn Lab Immunol，2014, ll：50-55.

[2]Smlth P L，Walkerpeach C R，Fulton R J，et al.A rapid sensitive multiplexed assay for detection of viral nucleic acids using the FlowMetrix system[J].Clin Chem，1998，44(9)：2054-2056.

[3]Opalka DA，Bianchi E.Analysis of the HIV—A gp41 specific immune response using a multiplexed antibody detection assay[J].J Lmmtmol Methods，2004，287(1-2)：49-65.

[4]熙雄.免疫芯片[J].齐鲁医学检验，2005，16(6)：1-3.