刘统斌，邬向东，杨东菁，王雪芹（1.上海现代哈森（商丘）药业有限公司，河南商丘476000；.河南中帅医药科技发展有限公司，郑州 45000；.河南大学医学院，河南开封 475001；4.河南省食品药品检验所，郑州45000）

盐酸米诺环素（M inocycline Hydrochloride，MH）为半合成四环素类广谱抗菌药物，具有高效、长效的特点。在四环素类抗菌药物中，本品的抗菌作用最强，抗菌谱与四环素相近而且对四环素耐药性金黄色葡萄球菌也有效。参照文献和我国新药审批办法中的有关规定[1～6]，笔者建立了高效液相色谱（HPLC）法测定犬血浆中的盐酸米诺环素含量，并对盐酸米诺环素缓释片（以羟丙基甲基纤维素为骨架）与进口参比制剂在Beagle犬体内的药动学进行对比研究，以阐释盐酸米诺环素缓释片的缓释特征，为处方筛选和临床研究提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

CP225D型电子天平（德国赛多利斯公司）；LC-6A HPLC仪，包括紫外检测器（日本岛津公司）。

1.2 试药

盐酸米诺环素对照品（批号：091001，含量：84.01%，使用前不需要干燥处理）和盐酸米诺环素缓释片（批号：20100508-1，规格：按米诺环素计每片90mg）均由河南中帅医药科技发展有限公司提供；进口盐酸米诺环素缓释片（美国BarrLaboratories公司，批号：701550，规格：按米诺环素计每片90mg）；咖啡因（中国食品药品检定研究院，批号：171215-200406，纯度：99%）；乙腈、庚烷磺酸钠为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

Beagle犬，体重9～11 kg，♀♂各半，购自南京市安立默科技发展有限公司，许可证号：SCXK（苏）2005-0003。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Scienhome C18（200mm×4.6mm，5µm）；流动相：乙腈-四氢呋喃-水（含1.5%三乙胺、2%庚烷磺酸钠，磷酸调pH至 3.0）＝150 ∶30 ∶850（V/V/V），流速：1.0 m L·min－1；柱温：35℃；检测波长：280 nm；进样量：50μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 贮备液的制备。称取盐酸米诺环素对照品适量，先用甲醇溶解，再用流动相稀释制成浓度为500mg·L－1的溶液作为对照品贮备液；另取咖啡因（内标）适量，同法制成浓度为0.5mg·L－1的溶液作为内标贮备液，分别置于冰箱冷藏保存。2.2.2 对照品血浆的制备。先将浓度为500mg·L－1的对照品贮备液，依次用流动相稀释成含盐酸米诺环素250、125、50、25、12.5、6.25、3.125mg·L－1的对照品溶液，再加入内标贮备液和空白血浆，制备成含盐酸米诺环素 10、5、2、1、0.5、0.25、0.125mg·L－1的对照品血浆。

2.3 血浆样品的处理与测定

取血浆样品0.5m L，加入浓度为0.5mg·L－1的内标贮备液100μL、pH7.2磷酸盐缓冲液1m L，涡旋0.5m in，加乙酸乙酯5 m L，涡旋3 m in，3 500 r·m in－1离心10 m in，吸取上清液 4.0 m L，再于40℃水浴中N2吹干。加流动相100μL，涡旋2min，12 000 r·m in－1高速离心10m in，取上清液按“2.1”项下色谱条件测定盐酸米诺环素的峰面积，以内标法进行定量分析。

2.4 系统适用性试验

在“2.1”项色谱条件下，取给药前犬的空白血浆、对照品血浆、犬给药后2 h血浆样品，按“2.3”项下方法处理并进样测定。结果表明，盐酸米诺环素达到基线分离，与血浆样品中的内标及杂质峰分离良好，保留时间约为6.42m in，内标咖啡因保留时间约为4.78min。色谱详见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B.对照品血浆；C.血浆样品（给药后2 h）；1.盐酸米诺环素；2.内标Fig 1 HPLC chromatograms A.blank plasma；B.controlsubstance plasma；C.plasma sample（2 h after adm inistration）；1.MH；2.internalstandard

2.5 标准曲线与定量范围考察

取空白血浆0.5m L，精密加入内标和不同量的盐酸米诺环素对照品溶液，使其含盐酸米诺环素分别为0.125、0.25、0.5、1.0、2.5、5、10mg·L－1，再按“2.3”项下方法处理，照“2.1”项下色谱条件进样测定，以浓度c（mg·L－1）为横坐标，盐酸米诺环素与内标的峰面积比值R为纵坐标进行线性回归。得回归方程为R＝0.219 9c+0.036 6（r＝0.999）。结果表明，盐酸米诺环素的检测浓度的线性范围为0.125～10mg·L－1，定量下限为0.125mg·L－1。

2.6 回收率试验

取不同浓度的盐酸米诺环素对照品溶液，加空白血浆制备成浓度为5、1、0.25mg·L－1的血浆样品，每个浓度各5份，以相应浓度的对照品溶液为对照，由二者峰面积之比计算盐酸米诺环素提取回收率和二者浓度之比计算方法回收率。结果，盐酸米诺环素的平均提取回收率为70.3%，平均方法回收率为89.3%。

2.7 进样重复性与精密度考察

按“2.6”项下方法制备5、1、0.25mg·L－1的血浆样品，照“2.3”项下方法处理，于同日内处理测定5次；另每日处理测定1次，连续测定3 d，计算日内和日间RSD。结果，本方法的日内RSD≤5.3%，日间RSD≤6.4%。

2.8 样品稳定性试验

按“2.6”项下方法制备5、1、0.25mg·L－1的血浆样品，分别分组处理如下：（1）新鲜制备组：立即按“2.3”项下方法处理血浆样品，并进样测定；（2）短期室温稳定性组：将制备好的血浆样品室温放置10 h后，再按“2.3”项下方法处理、测定；（3）反复冻融组：将在－20℃下冷冻的血浆样品取出室温复融，反复3次后再按“2.3”项下方法处理、测定；（4）－20℃冷冻储存组：将血浆样品置于－20℃中冰冻20 d后，再按“2.3”项下方法处理、测定；（5）处理后样品组：血浆样品按“2.3”项下方法处理后室温放置10 h，再进样测定。结果，在上述条件下，RSD均＜15%，表明血浆样品稳定性良好，满足生物样品的分析要求。

将盐酸米诺环素贮备液分别放置0、7、14 d后，按“2.2.2”项下方法制备成浓度为1mg·L－1的溶液，进样测定，根据盐酸米诺环素峰面积及其与内标峰面积的比值变化情况评价贮备液的稳定性。结果，盐酸米诺环素峰面积的RSD及其与内标峰面积的比值的RSD均＜3.96%，说明盐酸米诺环素贮备液的稳定性较好。

2.9 样品的采集与测定

取犬分为受试制剂（国产）组和参比制剂（进口）组，每组5只，禁食不禁水，14 h后灌胃给予相应盐酸米诺环素缓释片18 mg·kg－1（按临床常用剂量换算），给药后继续禁食6 h，分别于给药前和给药后0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、60 h采集各组犬前肢静脉血4m L，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，分离血浆，按“2.3”项下方法处理血浆，以盐酸米诺环素作为检测对象，用HPLC法测定血浆样品中盐酸米诺环素的浓度。另经1周的清洗期后，同法进行交叉实验，绘制2种制剂在犬体内的平均药-时曲线，结果见图2。

用DAS 2.0药动学软件计算2种制剂在犬体内的药动学参数。结果，受试制剂和参比制剂的tmax分别为（4.42±1.24）、（4.33±1.07）h，cmax分别为（4.29±1.13）、（4.34±0.83）mg·L－1，t1/2分别为（22.17±5.73）、（20.09±4.94）h，AUC0～60h分别为（48.19±16.64）、（48.31±15.00）mg·h·L－1，AUC0～∞分别为（54.81±16.39）、（53.62±16.01）mg·h·L－1。表明2种制剂在犬体内的药动学参数无明显差异。

3 讨论

图2 2种制剂在犬体内的平均药-时曲线Fig 2 M ean p lasma concentration-time curves of 2 preparations in dogs

盐酸米诺环素制成缓释片用于治疗12周岁以上非结节性中度或重度寻常性痤疮炎症损伤患者。本次实验选择化学稳定性好的咖啡因为内标[7]。用乙酸乙酯处理样品，既能够有效提取待测成分，又能够有效去除样本中基质对色谱柱和仪器的污染，方法简单，样品需要量少，适合大批量生物样品浓度的检测。

综上所述，本方法专属性强、灵敏度高，可有效检测犬血浆中盐酸米诺环素浓度；国产与进口盐酸米诺环素缓释片比较药动学参数无明显差异。

[1]国家食品药品监督管理局.化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则[S].2005.

[2]国家食品药品监督管理局.化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则[S].2005.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录ⅩⅨB.

[4]齐 靖，蒋海松，吴琳华.HPLC法测定盐酸米诺环素缓释片主药的含量[J].中国药房，2009，20（10）：781.

[5]高守红，温 燕，邬 蓉，等.注射用盐酸米诺环素在健康人体的药物动力学[J].药学实践杂志，2009，27（3）：193.

[6]宋庆翠，汤 震，仇益群.米诺环素胶囊对人体相对生物利用度的研究[J].中国药业，2001，10（2）：27.

[7]周玲洁，顾丽华，王以俭，等.米诺环素注射剂的药动学[J].中国新药与临床杂志，2005，24（10）：798.