潘晓青，魏 瑾，张 明，林 琳，单 虎，闫 蕊，贺 乐

(西安交通大学医学院第二附属医院心内科，陕西 西安 710004)

硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)系统由 Trx、Trx还原酶(thioredoxin reductase，TrxR)和还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)组成。Trx主要分为Trx1和Trx2。目前对该系统中TrxR和Trx1的研究已经相当广泛，对Trx2功能的研究相对较少。已有研究显示，它除了具有Trx家族基本的抗氧化应激作用外，还有保护内皮细胞、调节基因表达及促进细胞增殖等作用[1－3]。Trx2是存在于线粒体中的分子量12 kD的小分子蛋白，2000年Powis等[4]通过 Western blotting证实了 Trx2的线粒体定位。因其特异存在于线粒体又被称为线粒体型硫氧还蛋白。Trx2是线粒体内膜蛋白中清除活性氧簇的主要蛋白，在维持细胞存活、降低氧化应激以及调节线粒体细胞凋亡信号转导过程中起重要作用[5]。有研究显示低硒及冰泳刺激等因素可影响Trx系统的表达[6]。但是低硒对特异存在于线粒体的Trx2蛋白表达的影响及Trx2对心肌细胞损伤的影响尚不清楚。本实验拟对该问题作进一步研究。

材料和方法

1 主要试剂

心肌线粒体提取试剂盒购自北京宝赛;Trx2兔抗鼠多克隆抗体购自Proteintech;Fas相关死亡结构域蛋白(Fas－associated death domain protein，FADD)兔抗鼠多克隆抗体购自Bioss;辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)和超敏发光液购自Pierce Biotechnology，SP染色试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥公司。

2 动物

将36只2周龄SD大鼠随机分成低硒(low selenium，LS)组及对照(normal control，NC)组，每组18只(雌雄比例相同)，低硒组以人工合成低硒酵母饲料喂养(硒含量0.01 mg/kg)，对照组以本校实验动物中心提供的常规饲料喂养(硒含量0.1～0.3 mg/kg)。

3 主要方法

3.1 在体心功能检测 分别于第20周、30周及40周时进行，每个时点各选6只大鼠(雌雄比例相同，实验前禁食12 h)，20%乌拉坦(5 mL/kg)腹腔麻醉后，把大鼠仰卧固定于动物台上，连接导管与压力传感器，计算机上校准基线。分离一侧颈动脉，在颈动脉上剪一斜口，将动脉插管经该斜口送达左心室。固定动脉导管，稳定10 min，记录的主要指标有:左心室峰值收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒张末压(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左心室内压最大上升和下降速率(maximum rate of left ventricular pressure rise/decay，±dp/dtmax)。取10组连续稳定的数据，以Chart 5 for Windows软件进行分析。

心功能测量完毕后，麻醉状态下快速取心脏。用刀片切取1块大小约(3～5)mm×(3～5)mm×(10～15)mm的心肌组织，置于4%多聚甲醛中固定24 h后包埋成石蜡标本，用于免疫组化染色。另取约200 mg心肌组织，按线粒体提取试剂盒的说明提取心肌线粒体。

3.2 蛋白质免疫印迹(Western blotting) 用RIPA裂解液提取线粒体蛋白，超微量紫外分光光度仪对提取的蛋白进行定量后行Western blotting检测，每梳孔上样量30 μg，凝胶电泳分离后半干转移法转到PVDF膜上。Trx2的转膜条件为恒流1 mA/cm2膜面积，转膜时间20 min。电压依赖性阴离子通道1(voltage－dependent anion channel 1，VDAC1)转膜条件为恒流 2 mA/cm2膜面积，转膜时间 45 min。50 g/L脱脂奶粉封闭后加Ⅰ抗，Ⅰ抗孵育浓度为Trx2(1∶500)，VDAC1(1∶800)，孵育条件为 4 ℃ 过夜。以VDAC1作为内参照[7]。洗膜后加Ⅱ抗室温孵育2 h，PBST洗膜5 min×6次，用ECL显色并分析。

3.3 免疫组织化学法检测FADD的表达 采用免疫组化SP法，石蜡标本切片后常规脱蜡至水，抗原修复后滴加3%H2O2消除过氧化物酶。正常山羊血清封闭37℃15 min后，将FADDⅠ抗以1∶50稀释，4℃孵育过夜;复温20分钟，PBS浸洗。Ⅱ抗37℃孵育20 min，PBS浸洗;Ⅲ抗37℃孵育20 min，PBS洗5 min，3次。DAB显色，苏木素衬染，封片。设置对照组，用PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照，其它步骤相同。光学显微镜进行图片分析。结果判定:以细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性判断标准。每张切片观察3个高倍(×400)视野，每个视野连续数100个细胞，其中阳性细胞数与总细胞百分比即为阳性细胞指数。

4 统计学处理

结 果

1 低硒大鼠心肌线粒体Trx2蛋白表达结果

NC组大鼠在20周、30周及40周时，其心肌线粒体Trx2蛋白的表达水平无明显变化(P＞0.05);LS组20周时其心肌线粒体Trx2蛋白的表达水平已明显低于相应时段NC组大鼠，随着喂养时间延长，该组大鼠心肌线粒体Trx2蛋白表达的降低程度更为明显，经统计学分析，30周时明显低于相应时点NC组，亦明显低于20周的LS组，40周时明显低于相应时点NC组，亦明显低于20周及30周的LS组(均P＜0.05)，见图 1。

2 在体心功能检测结果

如表1所示，低硒喂养20周时，LVSP及+dp/dtmax已出现明显降低，而 LVEDP及－dp/dtmax与NC组比较无明显差异。30周、40周时，LS组收缩功能与舒张功能均较NC组减低;LS组随低硒喂养时间延长，LVSP及+dp/dtmax减低更为明显，30周 与20周、40周与30周及40周与20周 组间两两比较，差异均显著 (P＜0.05)。

Figure1.The expression level of Trx2 protein at different time points.NC:normal control;LS:low selenium;VDAC1:voltage－dependent anion channel 1，as an internal control..n=6.*P＜0.05 vs NC group at the same time point;△P ＜0.05 vs LS group at 20 weeks;#P ＜0.05 vs LS group at 30 weeks.图1 不同时点Trx2蛋白的表达水平

表1 不同喂养时间大鼠在体心功能测定结果Table 1.The results of in vivo cardiac function of rats at different time points(.n=6)

表1 不同喂养时间大鼠在体心功能测定结果Table 1.The results of in vivo cardiac function of rats at different time points(.n=6)

NC:normal control;LS:low selenium.*P ＜0.05 vs NC group at the same time point;△P ＜0.05 vs LS group at 20 weeks;#P ＜0.05 vs LS group at 30 weeks.

Time(week) Group LVSP(mmHg) LVEDP(mmHg) +dp/dtmax(mmHg/s) －dp/dtmax(mmHg/s)20 NC 130.30 ±3.72 －1.38 ±0.33 10430.00 ±808.567645.60 ±962.46 LS 113.30 ±2.21* －2.72 ±2.07 7366.10 ±455.61* 6851.03 ±654.3430 NC 118.97 ±5.31 1.43 ±2.51 8582.62 ±621.14 6255.50 ±728.67 LS 103.82 ±5.24＊△ －2.82 ±1.63* 6160.68 ±402.17＊△ 4982.80 ±613.21*40 NC 120.08 ±3.29 －0.92 ±1.59 8295.88 ±1318.29 6523.60 ±708.93 LS 97.74 ±2.87＊△# －2.88 ±1.18* 5381.21 ±646.72＊△# 3863.32 ±348.00*

3 心肌细胞凋亡情况的免疫组化结果

采用SP法染色，细胞内出现棕色颗粒视为凋亡阳性细胞。由图2可见，NC组棕色细胞较少，而LS组棕色细胞较多。经统计学分析，NC组间对比未见明显差异(P＞0.05)，LS组与相应时段NC组相比，差异均显著;LS各组间(30周与20周、40周与30周、40周与20周)相比，均有显著差异(P＜0.05)。

4 Trx2与心功能及心肌细胞凋亡指数之间的相关性分析

K－S法正态性检验显示，Trx2、LVSP和+dp/dtmax的P值均大于0.05，可视为近似正态分布资料，而心肌细胞凋亡指数数据为偏态分布。相关性分析结果为，Trx2与 LVSP的相关系数为0.872(P＜0.01)，见图 3;Trx2与 +dp/dtmax的相关系数为0.822(P＜0.01)，见图4。Trx2与凋亡细胞指数的相关系数为 －0.858(P ＜0.01)，见图5。

讨 论

Figure2.The immunohistochemical results of apoptosis of myocardial cells in rats at different time points(SP，×400).NC:normal control;LS:low selenium..n=6.*P ＜ 0.05 vs NC group at the same time point;△P ＜0.05 vs LS group at 20 weeks;#P ＜0.05 vs LS group at 30 weeks.图2 不同时间点大鼠心肌组织中细胞凋亡免疫组化染色结果

Figure3.Correlation between mitochondrial Trx2 expression and LVSP of rats.图3 大鼠心肌线粒体Trx2表达量与LVSP的相关性

Figure4.Correlation between mitochondrial Trx2 expression and+dp/dtmaxof rats.图4 大鼠心肌线粒体Trx2表达量与+dp/dtmax的相关性

Figure5.Correlation between mitochondrial Trx2 expression and apoptotic index of myocardial cells in rats.图5 大鼠心肌线粒体Trx2表达量与心肌细胞凋亡指数的相关性

Trx2的基本功能为抗氧化应激和抗凋亡作用，为了解Trx2在心肌细胞线粒体表达的动态变化及其对心肌细胞损伤的影响，本实验在前期低硒大鼠蛋白质组学研究的基础上，完成了低硒大鼠心肌线粒体中Trx2表达的动态变化及其在心肌细胞损伤中的作用研究，并对Trx2抗凋亡机制进行初步探讨。

张在香等[8]在观察低硒大鼠不同组织硒蛋白利用硒的优先性研究中，发现20周后才能明确观察到低硒对硒敏感蛋白的影响，其低硒大鼠造模时间为20周，为此，本研究参照该研究，从低硒喂养20周开始观察。在我们的研究中，大鼠低硒喂养20周时，与NC组相比，其Trx2蛋白表达已出现明显降低。随着喂养时间的延长，Trx2表达降低更明显。这与滕宗艳等[6]的研究结果相一致，他们低硒喂养大鼠14周，冰泳刺激5 min后用Western blotting法测大鼠心肌TrxR及Trx表达，发现常硒冰泳组TrxR及Trx蛋白表达增高。与常硒组相比，低硒冰泳组TrxR及Trx蛋白表达降低而血中脂质过氧化物含量增高。因此他们认为低硒条件下心肌Trx系统功能降低，遇到冰泳负荷时心肌不能及时清除过剩的自由基及修复损伤的蛋白，使心肌易受损伤。蔡成等[9]研究了Trx2对高氧肺损伤线粒体的保护作用，发现人肺腺癌A549细胞在高氧环境暴露48 h后，细胞线粒体中Trx2的mRNA表达和蛋白表达均减弱，A549细胞出现凋亡甚至损伤致死。这种变化表明Trx2表达减弱时对高氧肺损伤的线粒体的保护作用亦减弱。张超英等[10]对低硒与大鼠心肌组织脂质过氧化及心肌细胞损伤关系的研究显示，在12周时低硒组大鼠心肌组织中脂质过氧化产物丙二醛较加硒组显著为高，低硒组心肌凋亡细胞检出率为87.5%也明显高于加硒组(检出率25.0%)。在本实验中，低硒组大鼠心脏收缩及舒张功能均降低，心肌细胞出现明显凋亡，而Trx2的表达量与LVSP和+dp/dtmax呈正相关，与心肌细胞凋亡指数呈负相关(P＜0.01)。

根据已有研究，分析本实验Trx2表达下降的原因可能为:(1)线粒体通过氧化磷酸化过程为细胞提供ATP的同时产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，是生理状态下ROS产生的主要来源。低硒时含硒酶及有关蛋白合成减少，ROS清除不足，线粒体功能受损，ATP供应不足，导致Trx2蛋白合成减少;(2)氧化应激等因素可使氧化型Trx2增加，氧化型的Trx2更易被降解。Zhang等[11]研究认为氧化型的Trx2的降解可能由线粒体基质内Lon蛋白酶执行的，Lon蛋白酶是2002年才被发现的位于线粒体基质负责蛋白质量控制的酶，它的作用是把体内损坏的蛋白质分解并清除掉。Trx2的降解使线粒体抗氧化系统的主要蛋白Trx2减少，其结果导致细胞氧化损伤进一步加重，如此形成恶性循环。对于Trx2抗凋亡机制，Tanaka等[11]的实验显示Trx2与细胞色素C(cytochrome C，CytC)发生了免疫共沉淀反应，认为Trx2通过与线粒体基质中的促凋亡蛋白CytC锚定，二者形成复合物，通过抑制凋亡信号的传递而抑制细胞凋亡。而Trx2是否与CytC结合发挥抗凋亡作用尚有争议，还需进一步研究。

目前针对Trx2的研究大多数是从组织或细胞水平提取该蛋白来进行的，由于Trx2仅特异性表达于线粒体，为避免细胞内其它非特异性蛋白的干扰，提高样品蛋白中Trx2的丰度，使所得结果更加可靠，本研究首次采用了先纯化心肌线粒体，在此基础上提取线粒体蛋白来进行相关指标的测定，实践证明该方法是可行且可靠的。

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