郑云枫， 彭国平， 程建明， 丁 宁

(南京中医药大学药学院，江苏南京210029)

丹参注射液是由单味丹参药材制成的中药注射剂，具有活血化瘀、理气开窍之功效，临床常用于治疗冠心病、心绞痛［1］。化学成分研究表明，丹参及其制剂中主要含有酚酸类及二萜醌类活性成分［2-5］，相对而言丹参糖类成分的研究目前尚未深入。

为了进一步明确丹参注射液中化学成分组成，充分保证其质量可控及制剂安全，依据国家食品药品监督管理局 (SFDA) 《中药注射剂安全性再评价质量控制评价技术原则》相关要求［6］，针对丹参注射液中糖类成分开展了化学成分研究，在此基础上还对水苏糖在生产工艺条件下的转化进行了初步研究。

1 仪器及材料

AC—500型核磁共振仪 (瑞士 BRUKER公司);MARINER 5140质谱仪 (美国AB公司);液相分析用Waters 510型液相色谱仪;Phecda—NH2柱 (5 μm，250 mm×4.6 mm，江苏汉邦科技有限公司);EC—2000色谱工作站 (大连依利特分析仪器有限公司)。中压柱层析用BUCHI B—688中压系统，填料为氨基键合硅胶 (日本三菱公司，50～60 μm);D101型大孔吸附树脂 (沧州宝恩化工有限公司);葡聚糖凝胶(Sephdex LH—20);乙腈为色谱纯 (MERCK);甲醇为色谱纯 (淮阴精细化工研究院所);三乙胺为分析纯 (国药集团化学试剂有限公司);水为亚沸蒸馏水;其余试剂均为分析纯。

丹参注射液由上海华源安徽锦辉制药有限公司提供 (批号:05110209);水苏糖对照品 (SIGMAALDRICH，851787)，甘露三糖对照品 (SIGMAALDRICH，021654)，葡萄糖对照品 (110833-200904)，果糖对照品 (100231-200303)中国药品生物制品检定所提供。

2 方法与结果

2.1 糖类化学成分研究

2.1.1 精制与分离 取丹参注射液5 L，用盐酸调节pH值至3，过滤，滤液上 D101型大孔树脂(5 L)，收集流出液，调节pH至7，浓缩;浓缩液上中压柱色谱 (填料为氨基键合硅胶)，依次用90%、80%、70%、60% 乙 腈 水 溶 液 (各2000 mL)梯度洗脱，洗脱液分别收集，每100 mL为1流份，HPLC分析，合并含相同成分流份，再经葡聚糖凝胶色谱纯化，得化合物1(160 mg)，化合物2(60 mg)，化合物3(80 mg)，化合物4(100 mg)。

2.1.2 结构鉴定

化合物1:白色粉末，高分辨质谱 (ESI-TOF/MS)测定m/z:665.2093［M-H］－，确定分子式为C24H42O21。在质谱图中还可见几个特征碎片离子，分别为 485.1698［M-162-H2O-H］－，341.1017［M-2 × 162-H］－，179.0596［M-3×162-H］－，根据分子离子失去的中性碎片来推测，化合物1是由4个六碳醛糖组成的低聚糖。

单糖种类的分析:取化合物1，采用酸水解法进行水解，而后用HPLC法与已知的单糖进行对照，确定化合物1中含有果糖、葡萄糖及半乳糖。

连接顺序及方式:化合物1的13C-NMR谱中见有24个碳原子，结合DEPT谱及HSQC谱，可以确定其中含有1个季碳，18个CH，5个CH2，1HNMR谱中见有明显的三个糖的端基碳上的氢信号:5.19(1H，d，J=3.65)，4.66(1H，d，J=3.20)，4.70(1H，d，J=3.35)，其偶合常数均处在2～4 Hz之间，提示糖与糖之间的连接的苷键构型为α型。H-H COSY和HMBC谱中显示其主要相关信号见表1。根据以上信息，提示化合物1为“D-半乳糖1α→6-D-半乳糖 1α→6-D-葡萄糖 1α→2β-D-果糖”，检索为水苏糖。

为了确证以上推测的结果，用水苏糖对照品进行了HPLC分析，结果显示化合物1的Rt值与其一致，故鉴定化合物1为水苏糖，见表1。

化合物2:白色粉末，高分辨质谱 (ESI-TOF/MS)在裂解电压为+30 V时，可见准分子离子峰m/z:527.1588［M+Na］+，确定分子式为C18H32O16;当质谱裂解电压增强至+100 V时，图中除了准分子离子峰外，还可见典型碎片离子365.0961［M-162+Na］+和203.0472［M-2×162+Na］+，据此推测，化合物2是由3个六碳醛糖组成的低聚糖。采用酸水解法进行单糖种类分析，结果显示化合物2由一分子葡萄糖和两分子半乳糖组成，推测为甘露三糖。为了确证以上推测的结果，采用甘露三糖对照品进行HPLC分析，结果显示两者Rt值一致，故鉴定化合物2为甘露三糖。

表1 化合物1的NMR数据 (DMSO，500 MHz)Tab.1 NMR data of compound 1(DMSO，500 MHz)

化合物3:白色粉末，高分辨质谱 (ESI-TOF/MS)测得m/z:203.0631［M+Na］+，确定分子式为C6H12O6。HPLC分析其与果糖对照品的Rt值一致，故鉴定化合物3为果糖。

化合物4:白色粉末，高分辨质谱 (ESI-TOF/MS)测得m/z:203.0353［M+Na］+，确定分子式为C6H12O6。HPLC分析其与葡萄糖对照品的Rt值一致，故鉴定化合物4为葡萄糖。

2.2 生产工艺条件下水苏糖转化 对丹参药材及其制剂中糖类成分分析时发现，甘露三糖并非是从丹参药材直接提取所得，而是由其它糖类成分转化而来。基于糖类成分结构转化的规律，推测该成分可能是在生产过程中由水苏糖水解转化而来。为了验证，对水苏糖在不同生产工艺条件下的转化进行了研究。

2.2.1 色谱条件 Phecda-NH2色谱柱;流动相为乙腈-水-三乙胺 (70∶30，V/V);示差折光检测器(RID)，柱温30℃。

2.2.2 水苏糖转化实验 本实验模拟生产工艺条件，将水苏糖置3种不同pH值水溶液进行加热水解，检测反应前后溶液中的成分变化。

称取水苏糖对照品20 mg，共3份，置圆底烧瓶中，分别加入pH=2、pH=6、pH=9的水溶液 (采用盐酸或氨水调节pH)10 mL使溶解，加热煮沸1 h，放冷。分别吸取反应前后药液10 μL，HPLC分析。

2.2.3 结果 HPLC-RID检测结果如图1。由此可见，不同pH值条件下反应产物差异较大。当溶液pH值为9时，水苏糖未发生水解;pH=6时，加热1 h可使少量水苏糖转化成甘露三糖和果糖;而pH值降低至2时，溶液中的水苏糖水解明显，水解产物除甘露三糖和果糖外，还可见其它几个水解成分的色谱峰。水苏糖结构式和转化反应见图2。

图1 水苏糖在不同pH条件下转化产物HPLC色谱图Fig.1 Chromatography of transformation products of stachyose in different pH solution

图2 水苏糖转化反应Fig.2 Proposed transformation pathways of stachyose

3 讨论

3.1 本实验以丹参注射液为对象，共分离鉴定了4个糖类成分，其中水苏糖为丹参药材及其制剂中首次发现的四糖成分，其含有量在药材中较高。文献［7-11］报道，水苏糖是一种多功能的低聚糖，具有调节肠道微生态平衡，增殖双歧杆菌，提高机体免疫力等作用，被称为“超强双歧因子”。而丹参及其制剂功效广泛，其药效物质基础除了普遍认可的酚酸及二萜醌类成分外，所含糖类成分如水苏糖等是否也是活性成分，值得进一步的研究和探讨。

3.2 《中药注射剂安全性再评价质量控制评价技术原则》中规定，多成分制成的注射剂所测各类成分之和应大于总固体的80%。糖类成分作为丹参注射液中主要类型成分，对其进行研究并制定相应的控制标准，可以进一步保证制剂的质量稳定和临床用药安全。

3.3 前期对丹参药材中糖类成分分析时发现，药材中含水苏糖量较高，但并未检测到甘露三糖，为了明确制剂中甘露三糖来源，本实验对水苏糖在不同pH条件下的转化进行研究分析，结果表明水苏糖成分在中性及酸性水溶液中加热易水解脱去一分子果糖转化成甘露三糖 (见图2)，从而确证了制剂中甘露三糖的来源，初步阐明了丹参注射液生产工艺条件下水苏糖成分的转化［12］。本研究结果为丹参及其制剂生产制备过程中糖类成分的质量控制提供了研究基础。

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