李光荣 屈树行 张治秋 杨 剑 马 丽 高 玮

(河北省优抚医院内科，河北 石家庄 050051)

三参方对慢性萎缩性胃炎大鼠胃组织表皮生长因子表达及血清、胃黏膜一氧化氮含量和一氧化氮合酶活性的影响※

李光荣 屈树行1张治秋2杨 剑 马 丽3高 玮4

(河北省优抚医院内科，河北 石家庄 050051)

目的 研究三参方对慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠胃组织表皮生长因子(EGF)表达及血清、胃黏膜一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性的影响，以探讨其治疗CAG的作用机制。方法 将60只雄性Wistar大鼠按体质量分层随机分为6组，即正常对照组、模型组、维酶素组、三九胃泰组及三参方高(3.67 g/mL)、低(1.83 g/mL)剂量组，每组各10只。正常对照组予蒸馏水灌胃，自由饮食、饮水;其余各组采用复合因素造模法复制大鼠CAG模型，连续8周。造模成功后，三参方高、低剂量及维酶素组、三九胃泰组分别予相应药液10 mL/(kg·d)灌胃，正常对照组及模型组予等容积蒸馏水灌胃，连续35 d。观察各组大鼠胃组织EGF表达及大鼠血清、胃黏膜NO含量和NOS活性、胃黏膜组织形态变化情况。结果 模型组大鼠胃黏膜上皮细胞可见不同程度的变性、坏死、脱落，腺体有不同程度的萎缩，间质内有大量炎性粒细胞浸润。各药物组大鼠胃黏膜病变均有一定程度改善，其中三参方高剂量组大鼠胃黏膜腺体大小形态较一致，基本接近正常对照组。模型组大鼠胃黏膜EGF表达的OD值较正常对照组明显增强(P＜0.01)，血清、胃黏膜NO含量和NOS活性明显升高(P＜0.01)。维酶素组、三九胃泰组及三参方高、低剂量组OD值表达较模型组明显减弱(P ＜0.05，P ＜0.01)，血清、胃黏膜 NO 含量和 NOS 活性降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，其中三参方高剂量组OD值表达与其他各治疗组比较均明显减弱(P＜0.01)，胃黏膜NO含量低于维酶素组(P＜0.05)，血清NO含量低于三九胃泰组(P＜0.05);三参方低剂量组及维酶素组OD值表达均较三九胃泰组弱(P＜0.05)，三参方高、低剂量组和三九胃泰组大鼠血清NO含量低于维酶素组(P＜0.01，P＜0.05)。结论 三参方可通过抑制胃组织EGF的过度表达，降低NOS活性，抑制血清、胃黏膜NO的过度释放，促进胃黏膜细胞修复及再生，改善胃的功能状态，以达到治疗CAG的目的。

胃炎，萎缩性;慢性病;表皮生长因子;一氧化氮;一氧化氮合酶;疾病模型，动物;中药疗法

※项目来源:河北省中医药管理局2011年度中医药类科研计划项目(编号:2011094)

1 河北省枣强县人民医院中医科，河北 枣强 053100

2 河北省枣强县人民医院内科，河北 枣强 053100

3 河北省邯郸市复兴区疾病预防控制中心检验科，河北 邯郸056003

4 河北省中医院药剂科，河北 石家庄 050011

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)为消化系统常见病、多发病，是由多因素引起的胃黏膜慢性炎性病理改变。近年来研究发现，表皮生长因子(EGF)与胃黏膜疾病关系密切［1］。EGF是多肽生长因子之一，对胃黏膜具有保护作用，一旦过表达会使胃黏膜发生病变。此外，一氧化氮(NO)是一种对胃黏膜具有双向调节作用的生物活性因子，一方面对胃黏膜具有保护作用，另一方面又可介导胃黏膜损伤性的炎症反应［2］。三参方系经多年临床筛选治疗CAG的经验方，在临床上具有较好的临床疗效。为了探讨其作用机制，我们通过实验研究三参方对CAG模型大鼠胃组织EGF表达和胃黏膜组织形态变化的影响，以及对血清、胃黏膜NO含量和一氧化氮合酶(NOS)活性的影响，为临床应用提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠60只，雄性，体质量180～200 g，购自河北医科大学实验动物中心，许可证号SCXK(冀)2008－1－003，动物合格证号1001005。将实验大鼠放置于明、暗各12 h、温度18～22℃的清洁级实验室内，适应性饲养1周。

1.1.2 主要仪器 NO试剂盒、NOS试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所;SP9001试剂盒及DAB显色剂，北京中杉金桥生物技术有限公司;LAUDA－C3型循环恒温水浴箱，泰克仪器有限公司;MSE－25型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂;722可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;莱卡LEICA RM2245型石蜡切片机，莱卡上海分公司;Olympus BX－UCB型全能显微镜，日本Olympus公司;Motic Med6.0数码医学图像分析系统，厦门麦克奥迪光学仪器有限公司。

1.1.3 药物及试剂 三参方药物组成:党参、玄参、丹参、白芍药各15 g，白术、清半夏、陈皮各10 g，黄连、丁香、炙甘草各6 g。以上药物均购自石家庄乐仁堂医药股份有限公司，经鉴定符合国家2010年版《中华人民共和国药典》一部规定的相关标准。维酶素片(河北环海药业有限公司，国药准字H13023904)，三九胃泰胶囊(三九医药股份有限公司，国药准字Z44020704)。EGF兔抗IgG多克隆抗体，博士德生物工程有限公司;增殖细胞核抗原(PCNA)鼠抗IgG单克隆抗体，北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 取雄性Wistar大鼠60只，按体质量分层随机分为6组，即正常对照组、模型组、维酶素组、三九胃泰组及三参方高、低剂量组，每组各10只。

1.2.2 CAG模型制备［3］除正常对照组外，其余各组大鼠先用0.2%脱氧胆酸钠溶液1.5 mL/(只·d)灌胃，间隔5 h后，再用50℃热水2 mL/(只·d)灌胃。与此同时，采用饥饱失常法喂养，即2 d足量喂食，1 d停食。正常对照组大鼠予等容积蒸馏水灌胃，自由饮食、饮水。持续8周。

1.2.3 药液制备 三参方按中药汤剂煎煮方法煎煮浓缩，配制成3.67 g/mL(高剂量)和 1.83 g/mL(低剂量)浓度的水溶液，三九胃泰和维酶素均用蒸馏水分别配制成1.0 g/mL浓度的混悬液。

1.2.4 给药方法 造模结束后，三参方高、低剂量及维酶素组、三九胃泰组分别予相应药液10 mL/(kg·d)灌胃。正常对照组及模型组予等容积蒸馏水灌胃。连续35 d。

1.2.5 标本采集及制备 第35 d给药后禁食12 h(可自由饮水)后，将各组大鼠麻醉，取股动脉血，3 500 r/min，离心10 min，迅速分离血清，置4℃冰箱保存待检。同时迅速打开腹部，将胃分离取出，沿胃窦近幽门口至胃大弯方向取适宜大小的组织块，固定于4%多聚甲醛溶液中，常规石蜡包埋、切片，苏木—伊红(HE)染色。另在胃窦部取适量胃组织，用0.9%氯化钠注射液冲洗，滤纸吸湿后，称取湿质量0.3 g左右，冰水中制成10%匀浆，3 500 r/min，离心10 min，提取上清液，置4℃冰箱保存待检。

1.2.6 检测项目及方法 胃黏膜形态观察在光学显微镜下进行。免疫组化法观察胃黏膜EGF的表达，经DAB显色后，细胞胞浆着色呈棕黄色或黄褐色颗粒者为阳性表达，阴性背景细胞核呈浅蓝色或蓝色。在200倍视野下每张切片选择5个视野，分别经显微摄像系统输入微机，利用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统，分别计算每个视野的阳性细胞平均光密度值(OD)值，取其平均值对结果进行统计分析。血清和胃黏膜中NO含量和NOS活性测定均采用比色法，严格按照试剂盒说明书规定的方法检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，采用t检验。

2 结果

2.1 胃黏膜形态观察结果 正常对照组大鼠胃黏膜上皮细胞呈单层柱状，腺体排列整齐，腺上皮和腺管分界清楚，固有腺体及黏膜层毛细血管无扩张，未见炎症反应。模型组大鼠胃黏膜上皮细胞可见不同程度的变性、坏死、脱落，黏膜下小血管清晰可见，腺体有不同程度的萎缩，间质内有大量炎性粒细胞浸润。各药物组大鼠胃黏膜病变均有一定程度改善，其中维酶素组、三九胃泰组与模型组比较，胃黏膜腺体排列较为整齐，有少量炎性细胞浸润;三九胃泰组胃黏膜部分上皮细胞可见变性、脱落。三参汤高、低剂量组大鼠胃黏膜腺体排列较整齐，未见炎性细胞浸润，尤其是高剂量组大鼠胃黏膜腺体大小形态较一致，基本接近正常对照组。

2.2 各组大鼠胃组织EGF表达情况比较 免疫组化染色结果显示，EGF表达于胃壁细胞胞浆内，镜下呈棕黄色或黄褐色颗粒。正常对照组大鼠胃壁细胞胞浆内可见散在浅黄色颗粒表达。模型组胃壁细胞胞浆内表达明显增加，可见棕黄色颗粒密布，且部分融合成片。各药物组大鼠胃壁细胞胞浆内EGF的表达均有明显降低，其中三参方高剂量组EGF的表达较三参方低剂量组、维酶素组及三九胃泰组减弱。

2.3 各组大鼠胃组织EGF表达的OD值比较 见表1。

表1 各组大鼠胃组织EGF表达的OD值比较±s

表1 各组大鼠胃组织EGF表达的OD值比较±s

与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与维酶素组比较，△P ＜0.01;与三九胃泰组比较，#P＜0.05，##P＜0.01;与三参方低剂量比较，○P＜0.01

组 别 n OD值正常对照组 10 0.182 ±0.042＊＊模型组 10 0.364 ±0.036维酶素组 10 0.274 ±0.042＊＊#三九胃泰组 10 0.311 ±0.028*三参方高剂量组 10 0.207 ±0.041＊＊△##○三参方低剂量组 10 0.266 ±0.049＊＊#

由表1可见，模型组大鼠胃黏膜EGF表达的OD值较正常组明显增强(P＜0.01)。维酶素组、三九胃泰组及三参方高、低剂量组OD值表达均较模型组减弱(P＜0.05，P＜0.01)，其中三参方高剂量组OD值表达与其他各治疗组比较均明显减弱(P＜0.01)，三参方低剂量组及维酶素组OD值表达均较三九胃泰组减弱(P＜0.05)。

2.4 各组大鼠血清、胃黏膜NO含量和NOS活性比较见表2。

表2 各组大鼠血清、胃黏膜NO含量和NOS活性比较±s

表2 各组大鼠血清、胃黏膜NO含量和NOS活性比较±s

与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与维酶素组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;与三九胃泰组比较，#P ＜0.05

组 别 n NO血清(μmol/L) 胃黏膜(μmol/g prot)NOS血清(U/mL) 胃黏膜(U/mg prot)正常对照组 10 73.25±9.76＊＊ 5.71±0.84＊＊ 18.32±1.95＊＊ 2.33±0.31＊＊模型组 10 125.72 ±14.31 8.01 ±1.02 29.21 ±3.02 3.66 ±0.46维酶素组 10 98.85±9.63* 7.19±1.05* 21.28±2.16＊＊ 2.62±0.42*三九胃泰组 10 88.54±9.16＊＊△ 6.46±0.93* 20.63±2.26＊＊ 2.51±0.43*三参方高剂量组 10 78.65±8.25＊＊△△# 6.18±0.92＊＊△ 19.36±2.14＊＊ 2.41±0.38＊＊三参方低剂量组 10 84.38±10.57＊＊△ 6.89±0.86* 20.64±2.36＊＊ 2.59±0.51*

由表2可见，与正常对照组比较，模型组大鼠血清、胃黏膜NO含量和NOS活性明显升高(P＜0.01)。维酶素组、三九胃泰组及三参方高、低剂量组大鼠血清、胃黏膜NO含量和 NOS活性均较模型组降低(P＜0.05，P＜0.01)，其中三参方高、低剂量组和三九胃泰组大鼠血清NO含量低于维酶素组(P＜0.01，P＜0.05);三参方高剂量组胃黏膜NO含量低于维酶素组(P＜0.05)，血清NO含量低于三九胃泰组(P＜0.05)。

3 讨论

CAG属于中医学痞满、胃脘痛、胃胀等范畴，其发病多责之于饮食不节或恣食生冷肥甘厚味之品;或七情不畅，郁怒伤肝，肝气横逆犯胃致肝脾不和或肝胃不和;或劳倦过度，劳则气耗，脾胃之气大伤，无力运化水谷精微;或先天禀赋不足，无以充养后天，脾胃虚弱等。其病位主要在胃，病机为气阴不足，胃腑失养，气机失和。而脾与胃互为表里，同居中焦，肝主疏泄，主中焦气机之升降，所谓“土得木则达”，故本证治疗宜脾胃同治，肝胃同调。三参方方中党参配白术益气健脾养胃;玄参配白芍药、炙甘草滋阴益胃柔肝;丹参配陈皮调畅胃中气血;黄连配清半夏、丁香通降胃气。全方总以益气养阴、扶助中州为主，并佐柔肝之法。然六腑以通为用，胃气以降为顺，故于补益之中又寓通降之法，既可通降胃气，又防补益壅遏之弊，此即叶天士“治胃则宜凉润通降”之旨。诸药合用则气阴双补，脾胃健运，气机条畅，从而达到治疗CAG的目的。

EGF是一种能够促进多种细胞增殖分化的低分子多肽，主要由颌下腺、胃、胰腺、十二指肠黏膜的类似十二指肠腺(brun－ner腺)等分泌。该因子广泛存在于消化道内，可以调节消化道黏膜的生长、分化及成熟，抑制胃酸分泌，具有促进上皮细胞增殖、细胞保护和组织修复的作用，在保护胃黏膜免受损伤因子的破坏、维持胃肠黏膜的完整性方面起着重要作用［4］。EGF也是调节胃肠道动力的重要生理因子，能够影响许多器官平滑肌的收缩活动，延缓小肠动力及胃排空。此外，EGF还可以提高机体对葡萄糖和氨基酸的吸收，促进多种细胞生长，并能促进上皮细胞内脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及蛋白质的合成，营养细胞。由此可见，EGF的正常表达在CAG病变及修复过程中具有较为重要的作用，一旦表达过度，可引起胃黏膜细胞受损，细胞炎性反应加重、过度增殖，病变逐步进展，进而导致CAG。本实验结果显示，与正常对照组比较，模型组大鼠EGF的表达明显增强，表明EGF营养和保护胃黏膜的功能减弱，胃黏膜病变逐渐加重。经治疗后，三参方高、低剂量组与模型组比较，EGF表达均明显减弱，说明三参方可通过抑制胃组织EGF的过度表达，促进胃黏膜细胞修复及再生，改善胃的功能状态，这可能是三参方治疗CAG的作用机制之一。

NO是人体内的一种具有生物活性的信息分子，是生物体内重要的生理信使和病理介质，它不仅参与机体多种细胞的不同生理作用，而且还参与多种疾病发生发展的病理过程［5］。机体内的NO主要以L－2精氨酸为底物，并由NOS催化，在一些相关因子如黄素单核苷酸、还原型辅酶及四氢生物蝶呤等辅助下生成。NOS是NO合成过程中惟一的酶，根据NOS的编码基因和生物学特性，可将NOS分为内皮型(eNOS)、诱导型(iNOS)及神经型(nNOS)。巨噬细胞、内皮细胞等处为iNOS主要分布场所。一般iNOS基因在正常情况下并不表达，但在体内某些因素如细胞因子和内毒素的刺激作用下，才进行转录和翻译产生iNOS，进而活化产生大量NO。胃黏膜中NOS分布广泛，说明NO参与了胃的各种生理功能。NO在适度表达的情况下对胃黏膜产生保护作用，但NO释放过量可导致自身正常组织损伤，介导胃黏膜产生不同程度的损伤性炎症反应，表现为细胞毒作用［2］。本研究显示，模型组大鼠血清、胃黏膜NO含量增加，NOS活性增强，说明NO、NOS在CAG发生、发展过程中起着比较重要的作用，NOS活性增强、NO合成及释放过多介导了GAS的发病过程。因此，NO含量和NOS活性的变化可以作为CAG临床诊断和病情轻重的参考指标之一。经治疗后，三参方高、低剂量均可降低大鼠血清、胃黏膜NO含量和NOS活性，保护胃黏膜，促进胃黏膜修复，改善胃功能，此可能是三参方治疗CAG的又一作用机制。

［1］梅彦，姒健敏.表皮生长因子与慢性萎缩性胃炎研究进展［J］.国外医学:消化系疾病分册，2005，25(3):149 －151.

［2］王琳，任建林.一氧化氮与胃黏膜保护和损伤［J］.世界华人消化杂志，2005，13(21):2601 －2604.

［3］李红平，毛万姬，邹学正.丹白麦门冬汤对慢性萎缩性胃炎大鼠胃粘膜病理形态学的影响［J］.陕西中医，2007，28(2):243－245.

［4］Konturek PC，Konturek Sj，Brzozowski T，et al.Epidermal growth factor and transforming growth factor－alpha:role in protection and healing of gastric mucosal lesions［J］.European Journal of Gastroenterology ＆ Hepatology，1995，7(10):933 －937.

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Effect of Sanshenfang on epidermal growth factor expression of the gastric tissue and content of carbon monoxide and nitric oxide synthase activity in serum and gastric mucosa of rat model with chronic atrophic gas-tritis

LI Guangrong*，QU Shuxing，ZHANG Zhiqiu，et al.*Medical Department，Privilege Hospital of Hebei Province，Hebei，Shijiazhuang 050051

ObjectiveTo explore the effect of Sanshenfang on epidermal growth factor expression of the gastric tissue and content of carbon monoxide and nitric oxide synthase(NOS)activity in serum and gastric mucosa of rat model with chronic atrophic gastritis.Methods60 male Wistar rats，stratified by body mass were randomly divided into six groups，the normal control group，model group，Vitacoenzyme group，Sanjiuweitai group and Sanshenfang high－(3.67 g/mL)，low － dose(1.83 g/mL)group.Rats in normal control group were given distilled water，free food，drinking water.Remaining groups were copy the model of rat CAG by composite factors modeling method for 8 weeks.Sanshenfang high－，low－dose，Vitacoenzyme and Sanjiuweitai were given in different groups after the modeling for 35 days.EGF expression of the rat’s gastric tissue，NO content and NOS activity in serum and mucosa and gastric mucosa morphological changes were observed.ResultsRat gastric mucosal lesions have a certain degree improvement in each drug group，which size and shape of rat gastric mucosa glands in Sanshenfang high－dose group is more consistent with the normal control group.OD values of rat gastric mucosa VEGF expression in the model group were significantly enhanced in comparison with normal group(P ＜0.01).NO content and NOS activity in serum and mucosa was significantly higher(P ＜0.01).OD values of rat gastric mucosa VEGF expression in，Sanjiuweitai group and Vitacoenzyme group were significantly weakened as compared with that in model group(P ＜0.05，P ＜0.01)，NO content and NOS activity in serum and mucosa was decreased as compared with that in model group(P ＜0.05，P ＜0.01).OD value of the expression in Sanshenfang high － dose group were significantly weakened as compared with that in the other treatment group(P ＜0.01)，NO content in mucosa was lower than that in Vitacoenzyme group(P ＜0.05)，NO content in serum in was lower than that in Sanjiuweitai group(P ＜0.05).NO content in serum Sanshenfang high－ ，low －dose group and Sanjiuweitai group was lower than that in Vitacoenzyme group(P ＜0.01，P ＜0.05).ConclusionSanshenfang can suppress overexpression of EGF in gastric tissue，reduce NOS activity，inhibit the excessive release of NO in serum and mucosal，promote the repair and regeneration of gastric mucosal cells，and improve the functional state of the stomach and achieve therapeutic CAG.

Chronic atrophic gastritis;Epidermal growth factor;Nitric oxide;Nitric oxide synthase;Animal;Experiments;Chinese medicine therapy

R573.32;R285.5;R9－331

A

1002－2619(2012)12－1862－04

李光荣(1964—)，男，副主任中医师，学士。从事中医内科临床工作。研究方向:消化系统疾病的中医药治疗。

2012－06－09)