王喜超，涂阳科，吕凤岩

(天津市第一中心医院肾内科，天津 300192)

在以往的研究中发现血液透析患者有血管新生［1-2］，本研究的前期中也发现血液透析患者血清体外可以诱导血管新生［3］，并且氧化应激是导致血管新生的一个因素［4］。尿毒症血液透析患者更容易出现严重的心血管并发症，新生血管的丧失而导致的血管功能代偿不全可能为其原因之一。细胞凋亡是细胞的程序性死亡［5］，内皮细胞凋亡可能参与了尿毒症患者新生血管的丧失。而目前未见相关文献报道。本研究通过体外实验，对其进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 对象

选取天津市第一中心医院1998年09月至2008年10月的11例维持性血液透析患者及相同时期10例健康志愿者，所有对象均签署知情同意书。血液透析患者平均年龄(63.2±4.4)岁，原发病为慢性肾炎、高血压肾病和多囊肾等。所有患者均用碳酸盐透析，每周透析3次，每次4.0 h。采用二醋酸纤维素膜透析器。健康对照组平均年龄(58.3±5.1)岁，均为健康志愿者。两组的年龄、性别组成无统计学差异。

1.2 方法

1.2.1 血清的制备:透析患者在透析中动脉端采血，同时正常对照组清晨空腹采血，取血后立即低温离心(4 000 r/min，20 min)，取上层血清 -70℃保存备用。分别把透析患者血清及健康志愿者血清混合进行实验。

1.2.2 内皮细胞培养及实验分组:HUVECs由重庆医科大学组胚教研室惠赠(来源于美国ATCC公司)，内皮细胞常规培养于含100 mL/L胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI 1640培养基(Gibco公司)，置于37℃ 5%CO2培养箱中孵育。细胞分为实验组和对照组，实验组用含100 mL/L透析患者血清的RPMI 1640培养基，对照组用含100 mL/L健康志愿者血清的RPMI 1640培养基。

1.2.3 形成血管样结构的内皮细胞凋亡:把HUVECs接种于24孔培养板，经上述干预30和40 h，200倍光学显微镜下观察血管样结构形成与内皮细胞凋亡。

1.2.4 四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测内皮细胞增殖:把HUVECs以2×103/mL密度接种于96孔培养板，经前述培养及分组干预30和40 h后检测，每孔加入 MTT溶液(5 g/L)20 μL，继续孵育4 h，弃上清，每孔加入 DMSO 150 μL，室温震荡10 min，在波长570 nm处用酶标仪测量吸光度A值。每组、每个检测点设6个复孔，重复2次，结果取均值。

1.2.5 TUNEL法检测内皮细胞凋亡:把HUVECs以2×104/mL密度接种于96孔培养板，经前述培养及分组干预40 h后用4%多聚甲醛固定细胞1 h，再分别用3%H2O2甲醛溶液和0.1%Triton X-100封闭及通透。TUNEL反应混合物37℃孵育1 h，酶标荧光素抗体37℃孵育30 min，DAB显色。400倍光学显微镜下随机选择5个视野，计数每个视野阳性细胞数目，取平均值。

1.2.6 比色法检测内皮细胞内活性氧(ROS):把HUVECs以2×106个/L密度接种于48孔培养板，经前述培养及分组干预30和40 h后，弃上清，每孔加入200 μL蒸馏水，冰上吹打直至细胞溶解，每孔的200μL细胞裂解液按活性氧测定试剂盒(南京凯基生物)说明书检测，最后计算各孔细胞产生活性氧的能力。每组、每个检测点设6个复孔，实验重复2次，结果取平均值。

1.2.7 Western blot法检测内皮细胞caspase-3表达:把HUVEC接种于50 mL培养瓶，经前述培养及分组干预30和40 h后用PBS洗2次，加入细胞裂解液冰上吹打30 min，然后4℃ 12 000×g离心30 min，取上清用 BAC法进行蛋白定量。制备100 g/L SDS-PAGE 凝胶，蛋白加样量40 μL，100 V电压电泳2 h分离蛋白，然后用免疫印迹系统(20 mA，15 h)把蛋白转到PVDF膜上。转有蛋白的膜先用血清37℃封闭1 h，然后caspase-3 1∶300稀释的一抗(Santa Cruz)37℃孵育2 h，再用1∶1 000稀释的相应二抗37℃孵育1 h，最后用化学发光试剂显示目的条带，在美国Rio-Rad图像分析系统中爆光成像。每一样本重复5次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 形成血管样结构的内皮细胞凋亡

内皮细胞培养30 h后，对照组无血管样结构形成;实验组有血管样结构形成。培养到40 h后，对照组细胞数目较多，细胞生长状态良好;实验组形成血管样结构的细胞逐渐由长梭形变为圆形，胞质粗乱，细胞开始松散、脱落，内皮细胞凋亡(图1)。

图1 内皮细胞培养40 h后形成的血管样结构开始溃解Fig 1 Vascular networks collapse after endothelial cells exposed to serum medium for 40 hours(×200)

2.2 四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测内皮细胞增殖

实验组内皮细胞培养40 h吸光度值低于对照组(P＜0.05);也低于30 h吸光度值(P＜0.05)(表1)。

2.3 TUNEL法检测内皮细胞凋亡

内皮细胞培养40 h后，实验组形成血管样结构的内皮细胞阳性染色(胞核阳性或胞质、胞核都阳性)显著高于对照组(P＜0.05)(图2)。

2.4 比色法检测内皮细胞内活性氧产生(ROS)

内皮细胞培养30和40 h实验组内皮细胞产生的活性氧均高于对照组(P＜0.05)(表1)。

2.5 Western blot法检测内皮细胞caspase-3表达

内皮细胞培养30 h后caspase-3表达两组间无差异;培养40 h后实验组内皮细胞caspase-3表达强于对照组 (P＜0.05)(表1，图3)。

3 讨论

本研究之前的研究发现，血液透析患者血清在体外培养内皮细胞30 h后可以诱导血管新生，在本研究中的体外实验发现，内皮细胞培养40 h后，实验组内皮细胞增殖能力减弱，细胞数量开始减少，血管样结构溃解，新生为血管样结构的内皮细胞出现凋亡，而没有形成血管样结构的内皮细胞没有明显凋亡，表明血液透析患者血清在诱导血管新生的同时，又诱导了所形成血管样结构的内皮细胞凋亡，而这种凋亡导致了新生血管的丧失。新生血管的内皮细胞为什么出现凋亡，推测可能与以下因素有关［6-8］，首先，内皮细胞处于增生状态时更容易凋亡;其次，内皮细胞的凋亡是新生血管重塑的重要机制;最后，尿毒症毒素有促内皮细胞凋亡的作用。

表1 两组内皮细胞培养30和40 h后吸光度值、ROS生成及caspase-3相对内参表达比值Table 1 Optical absorptance value(x ±s，A value，n=12)，ROS production(±s，A value，n=12)and caspase-3 expression level relative to β-actin(n=5)in two groups after endothelial cells exposed to serum medium for 30 and 40 hours

表1 两组内皮细胞培养30和40 h后吸光度值、ROS生成及caspase-3相对内参表达比值Table 1 Optical absorptance value(x ±s，A value，n=12)，ROS production(±s，A value，n=12)and caspase-3 expression level relative to β-actin(n=5)in two groups after endothelial cells exposed to serum medium for 30 and 40 hours

＊P＜0.05 compared with control;#P＜0.05 compared with 30 hours.

group optical absorptance ROS production casp-3 ex urs contr 0.952±0.045 1.085±0.047 10.16±8.0 pression 30 hours 40 hours 30 hours 40 hours 30 hours 40 ho 3 10.54±8.37 0.47±0.02 0.57±0.02 trial 1.073±0.046* 0.838±0.041*# 25.08±7.86* 39.20±9.41* 0.43±0.04 0.83±0.03*

本研究发现在内皮细胞培养40 h，即新生血管内皮细胞凋亡时，实验组内皮细胞ROS产生明显多于对照组，表明ROS在血液透析患者血清促新生血管内皮细胞凋亡中起作用。有研究［9］显示，ROS在内皮细胞内可作为第二信使具有促细胞凋亡的作用，本研究结果与文献报道一致。

天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶系(caspase)主要介导细胞凋亡反应，也参与炎性反应［10］。在本实验中，血管样结构形成时内皮细胞caspase-3表达未见增加，在内皮细胞培养40 h时，即形成血管样结构内皮细胞凋亡时，caspase-3表达增加，说明caspase-3是这个凋亡过程的参与者。

因血管内皮细胞的凋亡而导致新生血管丧失可能进一步激活血小板和凝血系统，引起炎症反应，加重毛细血管的塌陷及血管壁的纤维化和硬化，可能促进了血液透析患者心血管并发症的产生。

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