王凤玫，王长楠，宋岩峰*

(1.南京军区福州总医院妇产科，福建福州350025;2.第二军医大学生理教研室，上海 200433)

盆底器官功能障碍性疾病(pelvic floor dysfunction，PFD)是严重危害中老年妇女健康的一大疾病，主要包括盆底器官脱垂和尿失禁。研究表明，尿失禁与盆底器官脱垂具有相似的发病机制，是多因素作用的结果。女性生殖系统由盆底肌、韧带、骨性骨盆所支撑。生殖泌尿系统机能的完整性和稳定性有赖于完整的、功能性的胶原蛋白纤维，这些纤维对于膀胱颈、尿道和盆底器官的稳定性具有重要作用。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是参与降解包括骨在内的全身各种组织细胞外基质的蛋白酶家族，包括基质中以及整合于质膜中的各种胶原酶和弹性蛋白酶等。研究表明，胶原蛋白降解的增加与盆底器官功能障碍性疾病有关。多数研究对象为尿失禁患者宫颈或宫骶韧带中金属蛋白酶的表达情况［1－2］，主要以基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1，MMP-1)为主，但 MMP-2亦可降解Ⅲ型胶原蛋白。本研究观察盆底器官脱垂患者阴道前壁组织中MMP-1、MMP-2的表达，探讨基质金属蛋白酶与女性盆底障碍性疾病(PFD)的关系。

1 材料与方法

1.1 实验对象及分组

在获得知情同意后，选择2008年8月至2010年5月就诊南京军区福州总医院的Ⅱ°以上(POP-Q评分)盆底器官脱垂(pelvic organ prolapse，POP)需要手术治疗的患者20例作为POP组，手术方式为保留或不保留子宫的全盆底重建术;以及同期因宫颈上皮内瘤变行全子宫切除但无SUI或盆腔脏器脱垂患者20例作为对照组。所选病例近3个月内均未服用雌激素类药物，无生殖道和尿道的急性感染。各组患者均无类风湿类关节炎、甲亢等影响胶原代谢的疾病。两组患者在年龄、产次、体重指数及绝经时间等方面无显著性差异。脱垂组患者的平均年龄为(56.3±3.1)岁，对照组患者平均年龄为(58.1±3.4)岁。脱垂组与对照组患者的体重指数、产次以及绝经时间分别为:(20.9±2.4)/(21.4±2.4)kg/m2，(2.3±1.8)/(2.6±1.4)次，(7.8±3.2)/(7.1±4.2)年。

1.2 组织提取

对照组和POP组采用开腹子宫切除术和全盆底重建术，术中提取患者阴道前壁12点钟处组织(1 cm×1 cm)放入标记的容器中，置－80℃低温保存。

1.3 MMP-1.2 mRNA的表达

按Trizol试剂盒说明提取组织总RNA，取上述RNA样品1.5 μg进行反转录反应，反应体系为20 μL，反应条件为37℃ 1 h，95℃ 5 min。取产物5 μL进行PCR扩增，MMP-1.2分别与内参照基因GAPDH的引物共管扩增。MMP-1的引物序列为:5'-GGAGCCCTGATGTTTCCC-3'及5'-ATGCGATTAC TACAGATACTGT-3';MMP-2引物为:5'-GCGGATCC AGCGCCCAGAGAGACAC-3'及5'-TTAAGCTTCCAC TCCGGGCAGGATT-3';GAPDH引物序列为:5'-TG TCTCCTGTGACTTCAACAGC-3'及5'-TGATGGTATT CGAGAGAA GGG-3';MMP-1.2及GAPDH预计扩增片段分别为346、646及326 bp。MMP-1反应条件为:94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 50 s，30个循环后，72℃延伸10 min。MMP-2 PCR参数为94℃ 60 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s。30个循环后，72℃延伸5 min。通过凝胶图像吸光度分析系统对PCR产物电泳条带进行灰度扫描，计算MMP-1.2与GAPDH吸光度值的比值作为MMP-1.2 mRNA的相对表达量。

1.4 组织MMP-1.2活性分析

标本于液氮下粉碎、匀浆、离心，取上清液，以Centricon浓缩柱按体积比离心浓缩6倍，BioRad蛋白定量试剂盒(北京赛驰生物科技有限公司)定量、分装。取20 μL上清液进行聚丙烯酰胺(SDS)凝胶电泳，浓缩胶浓度50 g/L(pH 6.8)，分离胶浓度100 g/L(pH 8.8)。电泳后，凝胶于50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)、5 mmol/L CaCl2、100 mmol/L NaCl、0.1%Triton X-100中浸泡振摇1 h，中间换液1次，不含Triton X-100的洗液洗5 min后，再用50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、5 mmol/L CaCl2、200 mmol/L NaCl、0.2 g/L NaN3、10 mL/L Triton X-100 的孵育液37℃条件下孵育18～24 h，考马斯亮蓝R250染色，脱色，干燥封胶。通过凝胶图像吸光度分析系统对结果进行灰度扫描，以平均吸光度(INT)和杂交信号面积(S)的乘积代表信号强度。

1.5 统计学分析

用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，组间用t检验。检测结果均以均数±标准差(±s)表示。

2 结果

2.1 两组患者阴道前壁组织MMP-1.2 mRNA的表达

脱垂患者阴道前壁组织中MMP-1 mRNA的表达明显高于对照组(P＜0.01)(图1，2)。

2.3 两组患者阴道前壁组织金属蛋白酶的表达

脱垂组患者阴道组织上清液中，活性形式MMP-1(42 ku)的表达明显高于对照组(P＜0.05)。而活性形式的MMP-2(62 ku)表达无差别，但脱垂患者阴道壁组织中MMP-2酶原(72 ku)却呈现高表达(P＜0.05)(图3，4)

3 讨论

随着人口老龄化和对生活质量要求的提高，盆底功能障碍性疾病的发病率有增高的趋势。据统计，60岁以上妇女的患病率可高达50%。目前很多研究认为，POP发生与盆底支持组织结构功能完整性的破坏密切相关，以机械性损伤如阴道分娩、阴道难产等引起的盆底肌肉、韧带及筋膜的破坏为主。但有一些无阴道分娩的患者也会发生盆底器官脱垂，而且在大部分脱垂患者中，脱垂是在分娩数年后才发生。因此认为除了机械性损伤外，还有其他参与机制。年老或绝经患者宫骶韧带的弹性明显降低，胶原蛋白代谢明显增强，进一步引起盆底肌肉及韧带功能减弱，这些机制是受金属蛋白酶控制［3］。胶原蛋白的异常代谢，胶原蛋白含量的减少、成分比例的改变以及金属蛋白酶表达的增加均与压力性尿失禁和盆底器官脱垂有关。压力性尿失禁患者阴道壁组织中 MMP-1的表达明显增强，而其抑制物TIMP-1的表达明显降低［1］。而压力性尿失禁与盆底器官脱垂具有相似的发病机制，那么盆底器官脱垂患者的阴道壁组织中MMP-1的表达是否也具有相似的趋势呢?本研究检测了MMP-1的mRNA表达，对其活性进行分析。结果表明，盆底器官脱垂患者阴道壁中MMP-1 mRNA的表达明显增加，酶活性分析显示结果与基因表达相一致。MMP-1活性增加的原因可能是因为基因表达和酶原合成增加有关。机体内生物酶发挥作用的同时亦有抑制物发挥着抑制酶活性作用。那么在脱垂患者中MMP-1酶活性抑制作用是否同时有所减弱，有待我们进一步去研究。

除了基质金属蛋白酶-1(MMP-1)外，研究表明，盆内筋膜中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)与盆底功能障碍性疾病的关系较密切。但有报道POP患者宫骶韧带中MMP-2的表达与对照组对比无明显差别［4］，POP患者宫骶韧带中MMP-2的表达与对照组对比明显升高［5］。作者认为可能此结果可能是由于入选患者的绝经状态影响，因为性激素可以影响金属蛋白酶的活性。作为与子宫关系密切的阴道顶端，脱垂患者中明胶酶的表达是否与宫骶韧带一致。为了排除性激素的影响，本研究选取的患者均为绝经后。研究表明与参考文献［4］研究结果相一致，POP患者阴道壁中MMP-2的表达与对照组对比无明显差别。但有趣的是，在本研究中发现POP患者阴道前壁中MMP-2的前体pro-MMP-2的表达却明显增加，此现象的发生需进一步实验研究。

以上研究表明，基质金属蛋白酶-1(MMP-1)通过降解胶原蛋白在生殖器官脱垂中发挥着重要作用，但MMP-1的高表达是否是脱垂发生的原因，仍需进一步研究证实。

［1］Chen Y，Desautel M，Anderson A，et al.Collagen synthesis is not altered in women with stress urinary incontinence［J］.Neurourol Urodyn，2004，23:367－373.

［2］Liapis A，Bakas P，Pafiti A，et al.Changes in the quantity of collagen typeⅠin women with genuine stress incontinence［J］.Urol Res，2000，28:323 －326.

［3］Reay Jones NH，Healy JC，King LJ，et al.Pelvic connective tissue resilience decreases with vaginal delivery，menopause and uterine prolapse［J］.Br J Surg，2003，90:466－472.

［4］Tomislav S，Marko V，Snjezana T，et al.Matrix metalloproteinases-1，-2 expression in uterosacralligaments from women with pelvic organ prolapse［J］.Marturitas，2009，64:132－135.