王潮岗，黄惠珠，孙海珊，胡章立，雷安平

深圳大学生命科学学院，深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室，深圳518060

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是单细胞、带鞭毛的真核光合生物，因具有培养简单、生长周期短、光合效率高和遗传转化技术成熟等优点，广泛用于生物学基础研究［1-2］.它可以在细胞中表达各种异源蛋白，如荧光素酶［3］和 SEC2蛋白［4］等;也可用于启动子功能的研究，如在莱茵衣藻中进行了 Rbcs2 启动子［5］和 Hsp 70A 启动子［6］功能的研究.但微藻启动子功能研究进展依然缓慢.究其原因，与未建立便捷、有效的研究系统直接相关.

目前，研究微藻启动子功能的手段包括缺失突变和点突变等，它们都需要合适的T载体辅助.缺乏商业化的微藻克隆、表达T载体，阻碍了微藻功能基因和相关启动子功能的研究.T载体一般包括克隆T载体和表达型T载体，一般通过平末端加T法和内切酶法获得［7-8］.T载体末端带有突出的T碱基，可直接与Taq酶扩增产物末端突出的A碱基配对，提高了聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)产物与载体的连接效率，促进对基因克隆与表达的研究［9］.然而，国内藻类启动子的研究主要集中在与光合作用、固氮作用相关基因的启动子上［10］，如 Rubisco 启动子［11-12］和 cpc 启动子［13-14］等，可检测藻类启动子功能的T载体鲜有报道.笔者认为，通过PCR获得启动子5'或3'端缺失片段，连接到T载体，转化到成熟的表达系统，再通过筛选基因或报告基因分析启动子功能，可实现对其快速检测.

莱茵衣藻作为研究真核微藻的模式生物，因其清晰的遗传背景和成熟的遗传转化体系，具有开发成微藻启动子功能检测系统的潜力.本研究尝试构建莱茵衣藻启动子功能检测T载体，并将PCR获得的雨生红球藻β－胡萝卜素酮化酶基因bkt1启动子［15］片段直接克隆到T载体上，在莱茵衣藻中验证启动子的功能，构建了一种新的检测微藻启动子功能的方法，为研究微藻启动子开辟了新的途径.

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株与衣藻

质粒091127-a3由本实验室筛选雨生红球藻基因组文库所得，测序分析发现其含有bkt1上游调控序列.质粒pSP124由英国伦敦大学Saul Purton教授惠赠，携带ble基因 (使宿主细胞获得腐草霉素和Zeomycin抗性)、Rbcs2启动子和终止子.载体pMD18-T购自Takara Biotechnology(大连)有限公司.

大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)菌株XL1由本实验室保存.

莱茵衣藻CC-849由美国杜克大学Chlamydomonas Genetic Center提供，培养在Tris-acetate-phosphate(TAP)培养基中.

1.2 试剂和仪器

质粒提取试剂盒、DNA片段纯化试剂盒和LA Taq酶 (含 dNTP、Taq酶和缓冲液)等均购自Takara Biotechnology(大连)有限公司;丙烯酰胺和TEMED等电泳试剂均购于Bio-Rad公司;十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate，SDS)、Tris碱和EDTA等购自生工生物工程 (上海)股份有限公司.以上试剂均为分析纯.

实验所用PCR仪为MJ-Research公司的PTC-100;冷冻高速离心机为Eppendorf公司的Centrifuge 5804 R;杂交箱为HL-2000 HybriLinker.

1.3 引物设计

根据091127-a3质粒上bkt1的上游调控序列设计引物pB-bkt4和pB-bkt5;根据pSP124质粒上的ble设计引物pBle1和pBle2;根据bkt1上游调控序列设计引物pcrto1、pcrto2、pB-bkt7和pB-bkt8，引物pB-bkt7和pB-bkt8引入了Eam 1105Ⅰ、EcoRⅤ和BamHⅠ位点;根据ble序列设计引物PrBle1和PrBle2，具体见表1.

1.4 莱茵衣藻启动子功能检测T载体的构建

pB124载体的构建.以pBle1和pBle2为引物，通过PCR从质粒pSP124中扩增出大小为970碱基对 (base pair，bp)的ble-3'-Rbcs2终止子 (扩增条件为94℃ 变性3 min;94℃反应1 min，58℃反应1 min，72℃反应1 min，25个循环;72℃ 延伸10 min)，克隆到pMD 18-T载体中，获得T-p124质粒.通过EcoRⅤ和KpnⅠ双酶切质粒T-p124获得ble-3'-Rbcs2终止子，将其插入pSP124载体的EcoRⅤ和KpnⅠ位点，获得pB124载体.

表1 引物列表Table 1 List of primer sets

pB载体的构建.通过Eam1105Ⅰ酶切pB124载体，获得线性载体，再经T4 DNA Polymerase使载体末端平滑化，突变原有的Eam1105Ⅰ位点，通过T4连接酶连接载体，获得pB载体.

pB-0.45T载体的构建.以pB-bkt4和pB-bkt5为引物，从091127-a3中扩增出3 735 bp的bkt1上游调控序列，克隆到pMD 18-T载体获得T-5'bkt.以pB-bkt9和pB-bkt10为引物，通过PCR从质粒T-5'bkt中扩增出450 bp的启动子序列，获得引入Eam1105Ⅰ、EcoRⅤ和BamHⅠ位点的启动子序列，命名为5'bkt1-0.45.通过EcoRⅤ和BamHⅠ双酶切5'bkt1-0.45，将其插入pB载体的EcoRⅤ和BamHⅠ位点，最后获得pB-0.45T载体，见图1.

1.5 启动子序列的T克隆

T载体的制备.采用 Eam1105Ⅰ 双酶切 pB-0.45T载体，于37℃反应1 h，酶切产物经琼脂糖凝胶 (琼脂糖质量浓度为10 g/L)电泳分离，回收的大片段即为T载体，经DNA片段纯化试剂盒纯化后可直接应用于PCR片段的T克隆.

图1 pB-0.45T检测T载体的构建Fig.1 Construction of pB-0.45T

启动子片段的T克隆.利用引物pcrto1和pcrto2，从质粒091127-a3中扩增出长度为1 986 bp的bkt1启动子片段，与T载体混匀，T4连接酶连接后转化到感受态大肠杆菌XL1细胞中，经氨苄抗生素筛选可获得转化子，经T3和T7引物测序验证 (深圳华大基因研究院)，命名为pB-2T.

1.6 莱茵衣藻的遗传转化

莱茵衣藻遗传转化采用“珠磨法”［16］.诱导时，加入3 mol/L的NaAC至终浓度为45 mmol/L.单个细胞遗传转化效率计算公式为

1.7 衣藻基因组DNA提取

微藻总DNA提取参照文献［16］的方法，如采用Qiagen®公司的Puregene Tissue Core Kit A提取微藻总DNA，则所有操作按产品说明书进行.

1.8 转基因衣藻的DNA-PCR检测

以提取的莱茵衣藻基因组DNA为模板，进行PCR扩增检测.使用特异性引物PrBle1和PrBle2扩增ble基因片段 (464 bp)，Act1和Act2扩增βactin基因片段 (852 bp).PCR反应条件为:94℃变性5 min;94℃反应1 min，58℃反应90 s，72℃反应90 s，30个循环;72℃延伸10 min.

1.9 转基因衣藻的Western杂交

将培养至对数生长期后期的藻细胞进行处理，取藻液25 mL，于4℃，5 000 r/min离心3 min，弃上清;加入1 mL PBS重悬藻细胞，小心加入0.5 mL玻璃珠 (Biospec 11079105)，加盖，冰上放置5 min;使用机械破碎机 (Mini-Beadbeater，Biospec)进行破碎，每次以最大速度破碎25 s，冰浴1 min，重复5次;然后，于4℃，12 000 r/min离心20 min，小心收集上清，上清即为藻细胞总蛋白.

微藻总蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离后，通过半干式电转仪 (Trans-Blot SD，Bio-Rad，美国)转移到硝酸纤维膜 (Hybond C-super，Amersham)上.显色根据产品说明书进行操作 (BCIP/NBT，aMRESCO®099OC099，美国).BLE多克隆抗体购自法国Invivogen公司，内参使用鼠抗β-Tubulin单抗 (EarthOx)，作为二抗的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG购自Proteintech公司.

2 结果与分析

2.1 莱茵衣藻启动子功能检测T载体的构建

其构建思路为:首先，利用PCR和酶切技术去除pSP124载体上的Rbcs2启动子;其次，利用T4 DNAPolymerasep突变启动子上面的一个Eam1105Ⅰ位点，以bkt1启动子的450 bp序列为间隔序列，并通过PCR引入了两个Eam1105Ⅰ位点，它的识别序列是5'-GACTTTACGTC-3'，从3'第5个碱基开始水解，因此Eam1105Ⅰ双酶切恰好在5'末端获得两个突出的T碱基，可与PCR产物3'末端突出的A碱基互补;最后，经过T4连接酶的连接即可将PCR产物直接连到载体上，形成完整的ble表达框，在莱茵衣藻中表达BLE蛋白 (使宿主细胞获得腐草霉素和Zeomycin抗性)，并通过Zeomycin筛选出转基因藻，见图2.

图2 pB-0.45T的T载体示意图Fig.2 Diagram-0.45T

pB-0.45T载体的鉴定.因 pB-0.45T载体由5'bkt1序列插入pB载体的BamHⅠ和EcoRⅤ位点得到，所以，它以450 bp的5'bkt1序列为间隔序列.采用引物pB-bkt9和pB-bkt10，可从pB-0.45T载体中扩增出450 bp的目的条带 (图3)，表明pB-0.45T载体含有450 bp的5'bkt1.通过Eam1105Ⅰ双酶切pB-0.45T，得到长度为450 bp和约3 000 bp的片段，通过EcoRⅤ和KpnⅠ双酶切得到970 bp和约 3 000 bp的片段 (图4)，表明 450 bp的5'bkt1序列是正向插入pB载体的.以上验证与pB-0.45T载体的构建吻合，表明已成功引入了两个Eam1105Ⅰ限制性酶切位点，由450 bp的bkt1启动子、ble和Rbcs2终止子组成了完整的ble表达框(图2)，莱茵衣藻外源启动子功能检测T载体已构建成功.

图3 pB-0.45T的PCR鉴定Fig.3 PCR analysis of pB-0.45T

图4 pB-0.45T的酶切鉴定Fig.4 Digesting pB-0.45T with restrictive enzyme

2.2 启动子序列的T克隆

pB-0.45T属于穿梭载体，具有氨苄青霉素抗性，可转化到大肠杆菌中筛选重组子.同时，为方便于启动子活性分析，引入两个Eam1105Ⅰ位点来构建T载体，通过Eam1105Ⅰ酶解获得插入PCR产物的T克隆位点 (图2).本研究通过PCR获得bkt1启动子 (1 986 bp)的5'缺陷序列，插入pB-0.45T载体的T克隆位点.PCR结果显示，1 986 bp的bkt1启动子序列已成功插入pB-0.45T中，pB-2T检测载体已构建成功，见图5.

2.3 转基因藻的获得

通过“珠磨法”将pB-0.45T和pB-2T检测载体转化入细胞壁缺陷的莱茵衣藻CC-849中，获得的转基因衣藻分别命名为TranB-0.45和TranB-2.同时建立一个阳性对照，将质粒pSP124转化进入莱茵衣藻CC-849中，获得的转基因衣藻命名为TranBle.

遗传转化结果显示:TranB-0.45未加醋酸钠时得不到转化子，加入后则单个细胞遗传转化效率提高到1.67×10－8，与 TranBle的转化效率接近，而TranBle上使用的Rbcs2启动子是莱茵衣藻转化效果最好的启动子之一，表明bkt1启动子的450 bp序列也可以用于莱茵衣藻转化.TranB-2未能获得转化子，可能是该启动子片段含有抑制外源基因整合的调控元件.各转基因藻遗传转化结果见表2.

图5 pB-2T载体的PCR鉴定Fig.5 PCR analysis of pB-2T

表2 转基因藻的遗传转化效率Table 2 Transformation frequency of transgenic algae

2.4 转基因藻的DNA-PCR鉴定

提取转基因衣藻TranB-0.45、TranBle和莱茵衣藻CC-849的基因组DNA，利用PrBle1、PrBle2引物对和Act1、Act2引物对检测转基因藻.结果显示，转基因藻TranB-0.45和TranBle均能扩增出464 bp的ble片段和852 bp的β-actin基因片段，与阳性对照结果一致.转基因藻均在TAP平板 (含10 μg/mL Zeomycin)上培养，经多次传代后再提取基因组DNA，PCR仍可扩增出ble片段(图6)，证明ble已经整合到莱茵衣藻基因组中，并可稳定传代.

2.5 各插入片段的启动子功能分析

离心收集培养至对数后期的转基因衣藻TranB-0.45和TranBle，提取其总蛋白，BLE抗体杂交，以检测转基因藻中BLE的表达情况.其中，TranBle为阳性对照，莱茵衣藻CC-849为阴性对照.结果显示，转基因衣藻TranB-0.45能正确表达BLE蛋白，在13.6 kD处显示清晰的杂交印迹，与阳性对照一致，表明450 bp的bkt1启动子片段可以正确表达BLE蛋白，具有启动子活性 (图7).以上结果表明，莱茵衣藻及本研究所构建的启动子功能检测T载体所组成的检测系统是有效的.

图6 转基因衣藻的PCR检测Fig.6 PCR analysis of transgenic algae

图7 BLE蛋白在转基因衣藻中的表达Fig.7 Expression of BLE in transgenic algae

3 讨论

T载体是一种方便、高效的克隆载体，是基因工程领域重要的研究工具.它可直接将PCR产物连接到载体上，通过测序获得序列信息，也可直接用于目的基因的表达研究［17］.目前，已有许多商业化的克隆T载体，如pMD 18-T(Takara)，表达型的T载体则还不太成熟，仅有少数公司提供，如pTARGET载体 (Promega)和pGW-T载体 (Qiagem).可用于启动子功能检测的载体已有研究，但未见任何商业性的T载体，很多实验仍通过常规的PCR扩增、克隆和酶切连接到特定的载体上，转化到宿主细胞后再进行检测，该方法工作量大、效率低，用于研究微藻启动子就更困难了.因缺少针对微藻研究的商业化T载体，大大阻碍了微藻基因工程的研究.因此，建立一个拥有表达型T载体的微藻启动子功能研究系统具有重要科学价值.

通过限制性内切酶获得可克隆PCR片段的T克隆位点，该方法具有方便、稳定的优点，是设计T载体的先进手段［18］.利用XcmⅠ双酶切获得的T载体具有高效、低背景的优点［17］.同样，利用Eam1105Ⅰ双酶切获得T载体的技术可以满足高通量克隆和表达基因的需要［19］.本研究采用Eam1105Ⅰ双酶切获得的T载体效率高，根据TA克隆的原理，插入的外源启动子序列与ble、Rbcs2终止子组成完整的ble表达框.但是，T克隆载体也有弱点，太长的片段不易被直接克隆，而启动子由于具有复杂的功能，序列有时会非常长，因此，pB-0.45T载体上还设计了BamHⅠ和EcoRⅤ限制性内切酶位点，可以满足大多数启动子的克隆与功能研究.如插入的启动子片段具有活性，正确表达BLE蛋白，则转基因衣藻细胞因具有Zeomycin抗性而被筛选出来;如不能表达BLE蛋白则不能获得转化子.由于莱茵衣藻对Zeomycin非常敏感，本研究未检测到假阳性.研究表明，450 bp的bkt1启动子具有与莱茵衣藻Rbcs2启动子同样能力，在莱茵衣藻中表达异源蛋白.pB-0.45T载体和莱茵衣藻适合作为微藻启动子功能研究的有效平台，有望推动微藻启动子功能研究.

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