张翼飞

（哈药集团制药总厂 黑龙江 哈尔滨 150086）

在青霉素G发酵生产菌种的制备过程中，菌种诱变筛选往往由于细胞壁的存在而影响其对外界理化因子的敏感性，因而我们采用细胞脱壁后再进行紫外线诱变处理的方法，选育高产优质菌种，大大提高了菌种细胞的变异率，加快了高产特性菌株的筛选过程，实践证明该方法是行之有效的。

1 实验材料

1.1 菌株

产黄青霉菌618#

1.2 培养基[2]

（1）斜面培养基（%）

甘油 0.75；甘油蜜糖 0.75；酵母浸处粉 0.5；NaCL 1;Ca-SO40.025;部分微量元素；琼脂 2.7；pH 6.8

（2）菌丝培养基（%）

玉米浆 6.1；蔗糖 2.0；CaCO30.5（调 PH 后加入）；pH 5.8

（3）再生培养基（%）

NaNO30.3;MgSO4·7H2O 0.05;FeSO4·7H2O 0.001;KCL 0.05;KH2PO40.1;

葡萄糖 4；酵母膏 0.2；琼脂 2.7；pH 6.8（用稳定剂配制）

（4）稳定剂

0.7 M NaCL

（5）种瓶培养基

以蔗糖、玉米浆为主要碳、氮源，pH5.8

（6）发酵瓶培养基

以乳糖、玉米浆为主要碳、氮源，加无机盐类组成，pH5.9

1.3 酶

纤维素酶+cellulase R—10

2 实验方法

2.1 原生质体的制备

（1）菌体培养

将618#菌种新鲜斜面加入适量无菌水，刮下菌株孢子制成孢子悬液，经玻璃珠打散过滤后取1mL接种于40mL的菌丝培养液中，28℃，240rpm条件下培养36h，得到菌丝体。

（2）胞壁酶处理

用4层无菌纱布过滤收集菌丝体，无菌水洗2-3次，再用稳定剂洗两次，取1g左右的菌丝体悬浮于5mL稳定剂中，加入5mg纤维素酶和5mg cellulase R-10，30℃恒温水浴振荡摇床60rpm，1.5-2h，镜检有大量原生质体释放后，用200目尼绒网滤除菌丝碎片和未酶解的菌丝体，滤液经1000rpm离心5min，弃上清，加10mL稳定剂重复离心两次，加入5mL稳定剂悬浮原生质体，备用。

2.2 紫外线诱变处理原生质体

取原生质体悬浮液适量，进行紫外线（253.7nm）诱变处理，分别照射 25′′和 40′′。

2.3 高产菌株的检出

将处理后的原生质体悬浮液涂于再生培养基平皿中，t=25℃，Φ=45±5%，恒温培养7天。……