周雪 ，范志勇 ，汤炜 ，张丽萌 ，李闰婷 ，周瑜 ，崔玉东

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.大庆市第四中学）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是一种重要的人兽共患病原菌[1]，常引起人类局部化脓感染，特别是医院内感染、器械植入感染、肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，严重者可致败血症、脓毒症等全身感染[2]；S.aureus也经常引起动物各种化脓性疾病，如鸡的化脓性关节炎，牛、羊的急性或慢性乳房炎，猪的流产、皮炎，马属动物的创伤感染、脓肿、蜂窝织炎等[3]，给人和动物的健康带来了巨大的危害。防治S.aureus感染的传统方法是抗生素疗法，但由于抗生素的滥用，耐抗生素的新菌株不断出现，特别是耐甲氧西林菌株的蔓延，使得单纯依靠抗生素治疗S.aureus引起的相关疾病越来越无效[4-6]，因此，利用疫苗防治S.aureus感染成为了全球的热点。传统的疫苗主要有全菌灭活疫苗、荚膜多糖疫苗和内毒素疫苗等，多年的研究证实，在临床上的免疫保护作用并不理想[7]。近年的大量研究表明，基因工程疫苗有望成为替代传统疫苗的新型疫苗，基因工程疫苗中最常见的是亚单位疫苗，亚单位疫苗具有针对性强和安全性高等优点[8-9]。实验室对S.aureus ClfA （Clumping factor A）[10]、IsdB （Iron-surface determinant B）[11]、Rap （RNAIII-activating protein）[12]和 TraP（Target of RNAIII-activiting protein）[12]蛋白进行了大量的动物免疫研究工作，我们发现ClfA、IsdA、Rap、IsdB和TraP蛋白都具有良好的免疫保护作用，小鼠免疫试验表明融合蛋白的免疫保护作用高于单个蛋白，但是融合蛋白的表达纯化受到其大小的限制，不能有效的将更多的具有良好免疫保护作用的蛋白融合起来，近年来兴起的表位疫苗能很好地解决这一问题，它可以在不影响有效的抗原活性位点的前提下尽量去除免疫反应性低的蛋白片段，而且可以避免与体内抗原存在的交叉反应[9]。要进一步研究S.aureus多抗原嵌合表位疫苗，就必须对这些蛋白的抗原表位进行研究，研究制备了抗TraP蛋白McAb的杂交瘤细胞株，为研究TraP蛋白的抗原表位奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 细胞、动物和质粒

骨髓瘤细胞 SP2/0和 6～8周龄 SPF级雌性BALB/c小鼠均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；重组菌 Rosetta（DE3）/pET30a（+）/trap、Rosetta（DE3）/pET32a（+）/gapc、Rosetta（DE3）/pQE30/isdB、BL21（DE3）/pET32a（+）/clfA、BL21（DE3）/pET32a（+）/clfB、BL21（DE3）/pET32a（+）/can 和 BL21（DE3）/pET32a（+）/fnbpA由黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院细胞生物学实验室构建保存。

1.2 主要试剂

改良型RPMI-1640购自Thermo公司；胎牛血清购自GIBCO公司；蛋白质Marker购自Fermentas公司；融合剂 PEG1500、DMSO、Goat anti-mouse IgGHRP、弗氏完全佐剂 （CFA）和弗氏不完全佐剂（IFA）购自Sigma公司；Ni-NTA His-Band Resin购自Novagen公司；单克隆抗体免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒购自Southern Biotech公司。

1.3 抗原制备与动物免疫

将 Rosetta（DE3）/pET30a（+）/trap 重组菌划线接种于含有100 μg·mL-1Amp的LB平板，37℃恒温过夜培养，挑单菌落接种于含有100 μg·mL-1Amp的LB液体培养基，37℃180 r·min-1振荡培养至OD600nm为 0.5～0.6，加入终浓度为 100 μg·mL-1的 IPTG，诱导时间为3 h。取诱导后的菌液，离心收集菌体，并用PBS清洗3次，超声破碎，4℃12000 rpm离心30 min，收集上清。按照Ni-NTA His-Bind Resin试剂盒说明书纯化蛋白，然后进行SDS-PAGE电泳，并用Gene Quant pro基因定量仪（Amersham）测其浓度。

三次免疫剂量均为100 μg TraP蛋白/只小鼠，取纯化的TraP蛋白100 μg溶解于100 μL PBS中，与等体积的弗氏佐剂充分混匀，对6～8周龄健康的BALB/c雌性小鼠进行皮下和腹腔多点注射免疫，首次免疫后分别于2周和4周用同样的方法进行第2次和第3次免疫，初免佐剂为CFA，此后免疫佐剂均为IFA，三免后10 d尾静脉采血，用间接ELISA方法进行血清抗体效价测定，效价达到1∶10000以上可用于融合。在融合前3 d，按200 μg·只-1腹腔注射TraP蛋白加强免疫。

1.4 确立McAb ELISA检测方法的最佳工作浓度

按段舒怡等报道的方阵滴定法进行间接ELISA[13]。以 1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800 系列倍比稀释抗原包被ELISA板，确定抗原的最佳稀释度；以 1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400 系列倍比稀释BALB/c雌性小鼠的阴、阳性血清，确定血清的最佳工作浓度；加入1∶5000工作浓度的HRP-羊抗鼠IgG与之作用，加入底物TMB显色，以2 M硫酸终止反应后测定OD450nm值。P/N≥2.1判定为阳性。

1.5 构建杂交瘤细胞株及腹水效价测定

参考《分子克隆实验指南》第三版介绍的方法进行细胞融合与选择性培养。用间接ELISA方法进行筛选，阳性细胞用有限稀释法对其进行克隆，三次单克隆化后扩大培养，冻存。

选8～12周龄健康的BALB/c雌性小鼠，腹腔注射无菌的IFA 0.5 mL·只-1。一周后，将培养的杂交瘤细胞吹打下来，2000 r·min-1离心3 min，弃上清，重悬细胞，计数备用。每只小鼠腹腔接种杂交瘤细胞1～3×106个。7～10 d 后，采集腹水。取少量腹水进行间接ELISA测定效价。

1.6 McAb特异性鉴定

1.6.1 McAb亚类鉴定

按照Southernbiotech/HRP抗体亚类试剂盒操作说明鉴定McAb的亚类。

1.6.2 交叉实验

采用间接ELISA的方法进行交叉实验，检测McAb 与实验室表达纯化的 ClfA、ClfB、Can、FnbA、IsdB和GapC蛋白之间的交叉反应。

1.6.3 Western-blotting鉴定

将纯化的TraP蛋白进行SDS-PAGE电泳，利用湿转化进行电转膜，以腹水McAb为一抗，HRP-羊抗鼠IgG为二抗，DAB显色，观察特异蛋白条带。同时设立SP2/0细胞注射小鼠制备的腹水作阴性对照。

2 结果

2.1 TraP蛋白表达与纯化结果

收集诱导后的重组菌，超声破碎后用Ni-NTA His-Bind Resin蛋白纯化系统对TraP蛋白进行纯化，纯化后测定其浓度，并进行SDS-PAGE电泳（图1），图中第5道可见清晰的单一条带，为纯化后的TraP蛋白，显示高纯度的抗原，其分子量为23 kD，浓度为 0.557 mg·mL-1。

图1 TraP蛋白表达与纯化的SDS-PAGE结果Fig.1 SDS-PAGE result of expressed and purified Recombinant protein TraP

2.2 确立最佳抗原工作浓度

方阵滴定实验结果显示，抗原1∶800稀释，阴性血清和阳性血清1∶1600稀释时，P/N值最大，为23.21。确定间接ELISA检测方法的最佳工作条件为抗原 1:800 稀释（0.070 μg/孔），血清 1∶1600 稀释。

2.3 单克隆抗体制备及效价测定

TraP蛋白免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合后第7 d可见细胞集落，融合率约为95%，融合10 d后用建立的ELISA方法筛选，经3次检测和3次克隆化后，获得11株稳定分泌抗TraP的McAb的杂交瘤细胞，连续传21代，细胞生长状态良好，反复冻存、复苏后，能保持稳定的抗体分泌能力。

用纯化的TraP蛋白作为抗原，通过间接ELISA检测细胞培养上清和小鼠腹水抗体效价。11株McAb 的细胞培养上清抗体效价在 1∶160～1∶5120 之间，而腹水抗体效价均到达1∶128000以上，明显高于细胞培养上清。

2.4 McAb亚类鉴定

按照McAb亚类鉴定试剂盒操作，对11株McAb 进行了鉴定，其中 8 株 McAb（2A1、3A6、3B1、1B4、2C5、4C7、5C3、2D8）重链为 IgG1 型，3 株 McAb（2A7、3A1、1C4）重链为 IgM 型，轻链均为 κ 链（表2）。

表1 单克隆抗体亚类鉴定结果Tabel 1 The result of identifiying subtypes of McAb

2.5 McAb特异性鉴定

2.5.1 交叉实验结果

经间接ELISA检测，8株IgG1型McAb分别与ClfA、ClfB、Cna、FnbPA、IsdB 和 GapC 六种不同载体表达的蛋白反应，OD450nm值均小于0.330。与阴阳性对照比较，结果表明8株McAb与ClfA、ClfB、Cna、FnbPA、IsdB和GapC蛋白均无交叉反应，具有良好的特异性（表2）。

表2 特异性试验-间接ELISA结果Table 2 Specific test of McAbs by indirect-ELISA

2.5.2 Western-blotting鉴定结果

TraP蛋白经SDS-PAGE后，以腹水初步纯化后的 McAb 2A1、3A6、3B1、1B4、2C5、4C7、5C3 和 2D8为一抗，DAB显色后，在23 kD处出现清晰条带，阴性对照以SP2/0腹水为一抗，结果表明8株McAb识别的是TraP蛋白的线性表位。

图2 单克隆抗体的Western blot鉴定Fig.2 Western blot assay of McAbs with protein TraP

3 讨论

1975年Koller和Milstein创建了杂交瘤技术并成功制备了单克隆抗体[14]，时至今日，该法在基础研究和应用研究中依然发挥了举足轻重的作用。与常规抗体相比，单克隆抗体具有特异性强和灵敏度高的优势。在制备单克隆抗体的过程中，最关键的步骤是细胞融合，影响融合成功的因素很多，如骨髓瘤细胞的选择，脾细胞制备以及融合剂的选择等。实验中所用的SP2/0细胞为不分泌抗体、对HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞株，处于良好的生长状态和在对数分裂期使用是获得高融合率的关键；脾细胞制备过程应当快速、轻柔，脾中的红细胞会降低融合率，应尽量去除；融合剂的分子量必须合适，分子量太小融合效率低，太大又极易引起细胞凝集，实验中应用的为PEG1500，取得了满意的效果。实验采用间接ELISA方法进行筛选和有限稀释法进行细胞单克隆化，操作简单，一次可以筛选大量的样本，并且具有较高的特异性和敏感性，能够快速高效的获得单克隆杂交瘤细胞株。

研究获得了11株能够稳定分泌抗金黄色葡萄球菌TraP蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中8株为IgG1型，3株为IgM型，IgM型抗体以五聚体形式作用，它是在初次免疫应答时最早出现的抗体，通常仅存在于血液内，对组织液或外分泌液中的保护作用没有多大贡献，而且纯化过程较为复杂，因此，后续的工作只对8株为IgG1型单克隆抗体进行研究。交叉试验中，不同表达载体表达的含有His标签的蛋白都不与McAb发生特异性反应，表明这8株单克隆抗体不是针对His标签或者其他蛋白的，具有良好的特异性，抗体效价理想，且western-blotting结果表明这8株单克隆抗体很有可能识别的是TraP蛋白的线性表位，为进一步利用噬菌体展示技术分析TraP蛋白的抗原表位奠定了基础。

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