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人股动脉粥样硬化斑块中表皮型脂肪酸结合蛋白与脂肪酸合成酶的表达

2012-06-20周志强

郑州大学学报(医学版) 2012年5期
关键词:长链脂肪酸硬化

陈 斌,陆 旭,周志强

郑州大学第二附属医院血管外科郑州450014

股动脉粥样硬化是全身动脉粥样硬化病变的重要组成部分。随着生活水平的提高,动脉粥样硬化所致的心脑血管和外周动脉硬化闭塞等疾病已经严重威胁到人们的生命健康和生活质量,研究动脉粥样硬化的病因和发病机制,寻找血管粥样硬化疾病的预防和治疗措施成为迫切需要。脂肪酸结合蛋白(FABPs)是能把脂肪酸从细胞膜转运到细胞内利用位点、在长链脂肪酸的代谢中起重要作用的一种低相对分子质量的胞质蛋白[1]。表皮型脂肪酸结合蛋白(E-FABP)是FABPs的一个亚型。脂肪酸合成酶(FAS)是多功能酶,参与软脂酸的合成过程。研究[2]表明腺癌组织中E-FABP可能结合和转运FAS合成的长链脂肪酸到细胞内代谢位点。该研究旨在通过检测人股动脉粥样硬化斑块组织中E-FABP、FAS蛋白及mRNA的表达情况,探讨二者的表达变化在人股动脉粥样硬化发生发展中可能的发病机制。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集郑州大学第二附属医院2008年1月至2011年5月股动脉粥样硬化斑块剥脱术中获取的内膜标本21例以及普外科外伤脾破裂脾切除术中脾动脉13例(对照组)。每位受试患者签订《股动脉粥样硬化斑块研究知情同意书》。术中获取标本后立即用PBS液洗去残留血并简单去除周围组织后液氮保存备用。

1.2 试剂与仪器 兔抗人E-FABP单克隆抗体和兔抗人FAS单克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司),RT-PCR试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司,引物由上海生工生物工程有限公司合成。E-FABP引物:正义链 5’-ACATGAAGGAGCTAG GAGT-3’,反义链 5’-TTCCCATCCCACTCCTGATGC-3’,扩增产物大小为245 bp;FAS引物:正义链5’-GACCGCTTCCGAGATTCCA-3’, 反 义 链 5’-CCT GAGGTCCCGAGATGGT-3’,扩增产物大小为415 bp;β-actin作为内参照,正义链5’-GGAGTCCACTG GCGTCTT-3’, 反 义 链 5’-CATCATATTTGGCAG GTTT-3’,扩增产物大小为481 bp。SP900试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限工程公司);PCR仪(美国ABI公司);显微成像系统(德国Lecia公司);Biosens Digital Imaging System v1.6图像分析系统(上海山富科学仪器有限公司);ImageQuant 100凝胶成像系统(美国GE公司)。

1.3 组织形态分析 将标本从液氮中取出后,经固定、脱水、透明、石蜡包埋后,6 μm厚切片。切片经常规脱蜡、水化后进行HE染色。按病理分类标准[3]分为稳定斑块组(9例)、不稳定斑块组(12例)和对照组。

1.4 人股动脉粥样硬化斑块组织和脾动脉组织中E-FABP、FAS蛋白表达的检测 采用SP法进行染色,具体步骤按SP900试剂盒说明书操作。阳性对照为已知的E-FABP和FAS蛋白染色阳性的组织切片,用PBS代替一抗作空白对照。显微镜下观察,棕黄色颗粒为E-FABP或FAS阳性表达。每张切片取5个视野进行图像采集,应用Biosens Digital Imaging System v1.6测量计算所采集切片的阳性细胞的积分光密度值[4],以5个视野的平均值表示该样本被测蛋白的表达。

1.5 人股动脉粥样硬化斑块组织和脾动脉组织中E-FABP、FAS mRNA表达的检测 取标本(动脉及内膜组织)50 g,匀浆后用Trizol试剂盒提取总RNA,用紫外分光光度仪测定其浓度和纯度,然后进行反转录。PCR反应条件如下:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸45 s,30个循环。PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,ImageQuant 100凝胶成像系统成像,用Gel-Pro Analyzer 4.0软件分析电泳条带,目的基因的相对表达量用各组目的基因与β-actin条带灰度值的比值表示。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0进行分析,3组E-FABP、FAS蛋白和mRNA表达的比较应用单因素方差分析和LSD-t法检验,应用Pearson相关分析动脉粥样硬化斑块组织中E-FABP、FAS蛋白和mRNA表达的关系,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 病理形态学观察 对照组脾动脉血管壁细胞排列整齐,血管内膜、中膜、外膜完整,内弹力层和外弹力层均清晰可见,内皮细胞连续分布呈线状。不稳定斑块组内膜明显增厚,细胞排列紊乱,内皮细胞排列不完整,斑块脂质坏死核心面积超过斑块面积的40%,斑块内见大量的泡沫细胞和炎性细胞,可见较多新生血管和胆固醇结晶,纤维帽较薄。稳定性斑块组脂质坏死核心面积小于40%或没有,泡沫细胞和炎性细胞少,纤维帽比较厚,有大量的钙化灶。见图1。

2.2 股动脉粥样硬化斑块和正常对照脾动脉组织中E-FABP和FAS蛋白表达比较 E-FABP和FAS棕黄色颗粒主要沉积在炎性细胞和泡沫细胞浸润的区域。见图2、表1。

表1 股动脉粥样硬化斑块和正常对照脾动脉组织中E-FABP和FAS蛋白表达比较

2.3 股动脉粥样硬化斑块和正常对照脾动脉组织中E-FABP和FAS mRNA表达比较 结果见图3、表2。

2.4 相关性分析 不稳定斑块组中 E-FABP和FAS 蛋白表达呈正相关(r=0.907,P=0.001),EFABP和FAS mRNA表达呈正相关(r=0.650,P=0.022);稳定斑块组中E-FABP和FAS蛋白表达呈正相关(r=0.675,P=0.046),E-FABP 和 FAS mRNA 表达呈正相关(r=0.778,P=0.014)。

图3 股动脉粥样硬化斑块和正常对照脾动脉组织中E-FABP与FAS mRNA的表达

表2 股动脉粥样硬化斑块和正常对照脾动脉组织中E-FABP和FAS mRNA表达比较

3 讨论

随着生活水平的提高和人口老龄化,动脉粥样硬化已成为严重威胁人民生命健康和生活质量的疾病,下肢动脉粥样硬化闭塞是全身动脉粥样硬化的局部表现。研究[5-6]表明动脉粥样硬化是血脂紊乱和炎症反应共同参与的慢性疾病,动脉粥样硬化斑块直接致血管腔狭窄和斑块的破裂、出血,继发血栓形成等。FABPs最基本的功能是参与脂肪酸从细胞膜转运到脂肪酸在细胞内被利用的位置的转运。石玉荣等[7]研究表明FABP2 T基因增高2型糖尿病并发冠心病的遗传易感性。Agardh等[8]研究显示脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)在人颈动脉粥样斑块中,特别是巨噬细胞中表达增高,E-FABP是FABPs家族中一员,且A-FABP 和 E-FABP 高度同源[9]。有学者[10]发现A-FABP促进动脉粥样硬化发展的机制可能与炎症因子、化学趋化因子有关。在巨噬细胞中,ox-LDL能诱导单核/巨噬细胞A-FABP mRNA和蛋白的表达[11]。长链脂肪酸可诱导 FABP的表达[12]。该实验结果显示动脉粥样硬化斑块组中E-FABP蛋白及mRNA表达量高于对照组,且不稳定斑块组的表达量高于稳定斑块组,蛋白主要表达在炎性细胞和泡沫细胞浸润的区域,提示从转录和翻译水平,E-FABP的表达上调与动脉粥样硬化的发生有关,且与斑块的不稳定性有关,可能与胆固醇的转运及炎症反应有关。作者推测在动脉粥样硬化的发生发展过程中,E-FABP可能通过长链脂肪酸、ox-LDL等物质或其他途径相互促进表达,高表达的E-FABP一方面将长链脂肪酸转运到巨噬细胞等脂肪酸利用场所,从而促使泡沫细胞的形成,另一方面FABP可能通过使炎症因子或化学趋化因子表达增加及通过其他途径产生炎症反应,加速动脉粥样硬化斑块的形成;炎症细胞特别是巨噬细胞的活化可以渗入到纤维帽,降低纤维帽的张力,促使斑块破裂,使斑块趋于不稳定。

FAS是催化合成长链饱和脂肪酸的关键酶[13],研究[14]表明粥样斑块脂肪酸并非单从食物中摄取,而可能部分在动脉内合成,且由FAS介导合成的饱和脂肪酸在不稳定斑块内的含量较高。张琴等[15]研究亦显示上调FAS水平可导致宿主细胞脂质沉积。Berndt等[16]研究表明炎症因子IL-6与人群内脏脂肪组织中的FAS基因表达量呈正比,可作为FAS表达的独立预测因子。该研究显示动脉粥样硬化斑块组中FAS蛋白及mRNA表达量高于对照组,且不稳定斑块组的表达量高于稳定斑块组,蛋白主要表达在炎性细胞和泡沫细胞浸润的区域。推测动脉粥样硬化过程中可能通过上调FAS的转录与翻译水平,使动脉内饱和脂肪酸的合成增加,脂质沉积,从而促使动脉粥样硬化形成,而炎症因子可能促进此过程。

相关性分析表明动脉粥样硬化组织中E-FABP与FAS的表达呈正相关,说明E-FABP与FAS在动脉粥样硬化形成过程中可能起协同作用。研究[5]表明乳癌组织中FABP5可能结合和转运FAS合成的长链脂肪酸到细胞内代谢位点。作者推测动脉粥样硬化组织E-FABP的表达可能因FAS的过度表达而上调,可能作为FAS信号系统的下游信号分子,结合和转运FAS的合成产物。

总之,人股动脉粥样硬化斑块中E-FABP与FAS的表达增高可能与人股动脉粥样硬化的发生及斑块不稳定性有关,且E-FABP与FAS在斑块中的表达呈正相关,E-FABP与FAS可能是联系脂质积累和炎症的重要的因子,具体机制尚需要进一步探究。抑制E-FABP与FAS在动脉粥样硬化斑块中的表达可能为下肢动脉粥样硬化及其他动脉粥样硬化疾病的治疗开辟新的领域,值得进一步研究。

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