罗向阳，张振武，曹振杰，王 伟

郑州大学第三附属医院泌尿外科郑州450052

尿道下裂是一种常见的儿童先天性尿路及外生殖器畸形，严重影响患儿的生活质量，其发病率为1/300～1/200，且近年来呈逐年增加的趋势［1］。研究［2］表明尿道下裂的发生与基因突变、细胞间异常信息传递及环境因素等有关。环境中广泛存在的雌激素和抗雄激素类物质的污染引起阴茎上皮细胞异常分化是其发病的主要原因，也是当今研究的热点［3］。Hedgehog信号通路是维持哺乳动物胚胎正常发育的基础之一，其家族主要成员Sonic hedgehog(Shh)与其受体Ptch1结合参与许多器官结构如神经管、肢体、肺、皮肤、毛发以及外生殖器等组织形态的发生，其异常表达可致多个脏器的畸形，而其异常激活则与多种肿瘤形成有关［3］。作者的前期研究［4-5］发现尿道下裂患儿包皮组织及抗雄性物质氟他胺(flutamide，Flu)暴露后的胎鼠及新生大鼠阴茎组织p53基因表达均上调，阴茎组织上皮细胞增殖受阻。该研究中作者进一步观察Flu暴露对胎鼠及新生大鼠阴茎组织Shh及其受体Ptch1表达的影响，探讨其与尿道下裂发病机制之间的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 总RNA提取试剂Trizol购自美国Gibco公司。随机引物Oligo dT12-18、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂(RNasin)及Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司。Shh和Ptch1及β-actin引物由上海英骏生物技术有限公司设计并合成。Flu由上海复旦复华药业有限公司生产(批号:H10950220)。

1.2 动物模型的制备及分组 选择河南省实验动物中心提供的定期受孕的健康SD雌性妊娠大鼠36只，参阅McIntyre等［6］的实验方法制作尿道下裂动物模型:随机分为Flu组(n=18)和对照组(n=18)，于孕12～16 d分别腹部皮下注射Flu或生理盐水100 mg/(kg·d)，2组动物均于胚胎19 d及出生后1、4、7 d各随机取8只子鼠，切取阴茎组织，液氮速冻后存于－80℃冰箱备用。

1.3 Shh和Ptch1 mRNA表达的RT-PCR检测采用Trizol试剂提取阴茎组织总RNA，逆转录为cDNA，以此为模板行PCR扩增。PCR引物序列及扩增产物大小见表1。扩增体系:模板cDNA 0.2～0.4 μL，10 × PCR buffer(含 MgCl2)1.5 μL，dNTP Mixture 1.2 μL，上、下游引物各0.6 μL，Taq DNA 聚合酶 0.1 μL，等离子水 11 μL。PCR 反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性40 s，72℃延伸1 min，不同温度(Shh为54℃，Ptch1为48℃)退火50 s，30个循环;最后72℃延伸7 min。然后用15 g/L琼脂糖凝胶电泳30 min。采用MUVB220凝胶分析系统(美国Ultralum公司)对扩增产物条带进行分析，以目的基因Shh和Ptch1扩增带与内参β-actin扩增带灰度值的比值作为其mRNA的相对表达量。

表1 PCR引物序列及扩增产物大小

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0处理数据。同一组内不同时间点间Shh和Ptch1 mRNA表达水平的比较应用单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验;同一时间点2组间Shh和Ptch1 mRNA表达水平的比较应用两独立样本的t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组大鼠阴茎组织中Shh mRNA的表达 对照组Shh mRNA的表达在孕19 d～出生后4 d随鼠龄增加，表达逐渐增强，此后减弱。Flu组在孕19 d～出生后7 d随鼠龄增加逐渐增强，并且Flu组在孕19 d及出生后1和4 d，Shh mRNA的表达水平均低于对照组。见图1、表2。

图1 2组大鼠阴茎组织Shh基因的表达情况

表2 2组胎鼠及新生大鼠阴茎组织Shh mRNA的表达比较(n=8)

2.22 组大鼠阴茎组织中Ptch1 mRNA的表达 对照组Ptch1 mRNA的表达在孕19 d～出生后7 d随鼠龄增加无明显变化，而Flu组有增强的趋势。见图2、表3。

图2 2组大鼠阴茎组织Ptch1基因的表达情况

3 讨论

人类正常外生殖器的发育起始于胚胎发育的第6周，尿生殖窦腹侧开始出现突起，形成尿生殖嵴，不久生殖嵴的两端融合，呈结节样隆起形成生殖结节，两侧的隆起为尿道襞。至胚胎7～9周，在雄性激素作用下，来自内胚层的尿生殖窦(即尿道板)被尿道襞引导沿腹侧中线由背侧向腹侧不断延伸，从后向前逐渐融合形成完整尿道。各种原因引起的尿道板的融合障碍，均可导致尿道下裂［2，7］。

环境中广泛存在的雌激素和抗雄激素类物质如杀虫剂、天然植物激素、塑料制品的副产品、药物等的污染可能是造成尿道下裂发病率上升的原因，它们可通过不同的分子机制干扰雄激素的作用，影响男性外生殖器的发育，导致尿道下裂的发生［8-9］。研究［10］发现大鼠胚胎期12～16 d相当于人类胚胎8～16周，因此作者参阅 McIntyre等［6］的实验方法，在大鼠孕12～16 d给予Flu干预，探讨宫内抗雄性物质干预对Shh及其受体Ptch1表达的影响。

Shh及其受体Ptch1是调控胚胎期细胞增殖分化的重要因子，其作用主要是促进间充质细胞转化为尿道襞上皮细胞［11］。此外，Shh及其受体Ptch1主要通过阻断细胞周期调节蛋白p21诱导的生长抑制，促进细胞从G1期向S期转化及G2向M期转化，调控细胞增殖分化［12-13］。该研究结果显示Flu干预后Shh mRNA的表达在孕19 d和出生后1 d和4 d较对照组显著减弱，其受体Ptch1 mRNA的表达在孕19 d和出生后1 d较对照组减弱，但2指标随出生时间的增加有升高的趋势。以上结果提示宫内抗雄性物质干预在胚胎发育期及出生早期可能通过下调Shh基因及其受体Ptch1的表达，使尿道襞间充质细胞与上皮细胞转化异常，引起尿生殖结节的表面和尿道襞中间的位置融合障碍，尿道开口的位置异常;在出生后期Shh表达增强则会使尿道形成后期尿道襞上皮细胞过度增殖，使尿道板腔化受阻，上皮细胞残留而阻碍两侧尿道襞吻合，进而影响尿道缝形成，最终可能导致尿道下裂的发生。

总之，宫内抗雄性物质暴露可调控阴茎组织Shh及其受体Ptch1的表达，引起尿道襞间充质细胞与上皮细胞转化异常，尿道板腔化受阻，可能与尿道下裂畸形的发生有关。

［1］Giwercman A，Giwercman YL.Environmental factors and testicular function［J］.Best Pract Res Clin Endocrinol Metab，2011，25(2):391

［2］Kalfa N，Philibert P，Baskin LS，et al.Hypospadias:interactions between environment and genetics［J］.Mol Cell Endocrinol，2011，335(2):89

［3］Kalfa N，Sultan C，Baskin LS.Hypospadias:etiology and current research［J］.Urol Clin North Am，2010，37(2):159

［4］罗向阳，王伟.宫内抗雄性物质暴露对胎鼠及新生大鼠阴茎组织p53和细胞周期调节基因表达的影响［J］.实用儿科临床杂志，2011，26(14):1137

［5］罗向阳，王伟.尿道下裂患儿包皮组织p53和p21waf/cip1 mRNA 的表达［J］.郑州大学学报:医学版，2011，46(6):898

［6］McIntyre BS，Barlow NJ，Foster PM.Androgen-mediated development in male rat offspring exposed to flutamide in utero:permanence and carrelation of early postnatal changes in anogenital distance and nipple retemion with malformations in androgen-dependent tissues［J］.Toxicol Sci，2001，62(2):236

［7］Main KM，Skakkebaek NE，Virtanen HE，et al.Genital anomalies in boys and the environment［J］.Best Pract Res Clin Endocrinol Metal，2010，24(2):279

［8］Jakobovits A，Jakobovits A.Intrauterine development，functions and diseases of male reproductive organs［J］.Orv Hetil，2010，151(39):1573

［9］Thorup J，McLachlan R，Cortes D，et al.What is new in cryptorchidism and hypospadias--a critical review on the testicular dysgenesis hypothesis［J］.J Pediatr Surg，2010，45(10):2074

［10］Kim TS，Jung KK，Kim SS，et al.Effects of in utero exposure to DI(n-Butyl)phthalate on development of male reproductive tracts in Sprague-Dawley rats［J］.J Toxicol Environ Health A，2010，73(21/22):1544

［11］Angeloni NL，Bond CW，Monsivais D，et al.The role of hedgehog-interacting protein in maintaining cavernous nerve integrity and adult penile morphology［J］.J Sex Med，2009，6(9):2480

［12］Parkin CA，Allen CE，Ingham PW.Hedgehog signalling is required for cloacal development in the zebrafish embryo［J］.Int J Dev Biol，2009，53(1):45

［13］Podlasek CA.Sonic hedgehog，apoptosis，and the penis［J］.J Sex Med，2009，6(Suppl 3):334