汪长中 邵菁 汪天明 程惠娟

(安徽中医学院中西医结合临床学院，合肥230038)

近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂的广泛应用，导管插管、腹膜透析、器官移植、肿瘤放化疗等的大量开展，以及艾滋病患者的不断出现，免疫功能抑制人群逐渐增多，以念珠菌为主的真菌感染发生率呈逐年上升趋势。据报道，在院内获得性感染中，念珠菌引起的感染在血源性感染中位居第四位，在导管相关性感染中居第三位，即便使用了抗真菌药物，其死亡率仍高达40%。在所有念珠菌感染中，以白念珠菌 (Candida albicans)感染率最高，占45%［1］。白念珠菌病已经成为影响人类生活质量、威胁生命健康的重要疾病之一。白念珠菌所引起的慢性难治性感染目前认为与生物被膜形成密切相关。

白念珠菌生物被膜(biofilm)是白念珠菌附着于活体组织或非活体组织表面、由自身产生的基质(matrix)-胞外多聚化合物 (extracellular polymeric substances，EPS)包裹的有一定结构和功能的菌细胞群体，它是菌细胞在长期进化过程中所表现出的为适应环境压力而形成的与浮游菌(planktonic)迥然不同的另一种生存方式。典型的白念珠菌生物被膜结构表现为基底数层酵母相细胞黏附于物体表面，其上方有丰富的基质覆盖，内有大量菌丝生长，被膜厚度可达50～350 μm［2-3］(见图1)。生物被膜状态的白念珠菌不仅各种表型如形态结构、生理生化特性、致病性、对药物的敏感性等与浮游状态菌有显著差异，其基因型也与后者有所不同［4］。生物被膜不同于悬浮菌的诸多特征与其所含的基质密切相关，基质不仅参与生物被膜结构组成，还可帮助被膜菌逃逸机体免疫系统的攻击以及对抗药物的抑制或杀伤，且可通过酶降解EPS造成被膜菌在体内播散从而造成慢性、难治性感染，同时基质也是抗生物被膜感染的靶点，抑制其合成或促使其降解即可抑制或破坏生物被膜。因此，对基质的研究逐渐成为近年来生物被膜领域的热点之一。本文现就近年来白念珠菌生物被膜基质的研究进展作一综述。

图1 扫描电镜下白念珠菌生物被膜基质 (箭头指示处)［3］Fig.1 Scanning electron micrograph of biofilm formation of C.albicans(Arrows indicate matrix material)

1 生物被膜基质的概念及组成特点

生物被膜基质 (biofilm matrix)是由菌细胞分泌的黏性的胞外多聚化合物(EPS)，EPS再将菌细胞包裹于其中进而形成生物被膜。在生物被膜中，菌体本身所占比重不超过生物被膜干重的10%，而基质则超过90%［5］。生物被膜基质由多种成分组成，主要包括:

1.1 多糖

多糖是基质EPS的重要组分，分子量一般在(0.5～2)×106，电镜下呈细线状，黏附至菌细胞表面并形成网络结构，基质缺乏会造成生物被膜成熟障碍［5］。Lal等［6］用色谱技术分析出白念珠菌生物被膜基质中含有一大约300 kDa的水溶性胞外多糖，由葡萄糖、甘露糖、鼠李糖和N-乙酰氨基葡萄糖组成。Al-Fattani等［3］在比较白念珠菌与热带念珠菌生物被膜基质组分及其耐药性关系时，证实白念珠菌生物被膜基质中糖类占39.6%，其中葡萄糖含量最高，占32.2%，另有少量甘露糖、半乳糖等。由葡萄糖聚合而成的β-1，3-葡聚糖是白念珠菌生物被膜基质的重要组分。

1.2 蛋白

基质中的蛋白有些具有酶活性，能降解多糖、蛋白、核酸、纤维素、几丁质、脂质等多聚物，所形成的低分子量降解产物可以作为碳源和氮源提供给被膜内菌;有些酶对于结构性EPS的降解可以促进被膜内菌细胞播散 (dispersion);还有些酶在生物被膜致病过程中作为毒力因子。有些则为结构蛋白，如糖结合蛋白(凝集素)参与了多糖基质网络结构的形成及稳定，并将菌细胞表面与EPS连接起来。Thomas等［7］应用蛋白组学技术比较了白念珠菌生物被膜和悬浮菌的蛋白组成方面的异同，发现两者的蛋白表达谱高度相似，并进一步鉴定出数个差异表达蛋白，同时证实这些差异蛋白具有代谢酶活性(此前被称为细胞表面蛋白和免疫优势抗原)。就蛋白组分而言，生物被膜基质中的蛋白质可以分为两类:一类是分泌蛋白组(secretome)，如几丁质酶活性的Cht3p，具有免疫调节功能的甘露糖蛋白Mp65和作为细胞表面抗原及黏附素的Mp58/Pra1p等。另一类则为非分泌蛋白，包括糖酵解酶、生物合成酶、线粒体蛋白等。

1.3 核酸

研究证实，胞外脱氧核糖核酸 (extracellular DNA，eDNA)是铜绿假单胞菌、葡萄球菌等细菌生物被膜EPS中的重要组分，那么eDNA是否也是白念珠菌生物被膜EPS的重要组分呢?Martins等［8］构建了流动状态下生物被膜模型，检测白念珠菌生物被膜 EPS中eDNA的存在及其含量、DNA酶(DNase)干预效果、加入外源性DNA对生物被膜形成的影响等，结果证实生物被膜基质中eDNA的存在。在96孔板中所构建的静态生物被膜中，加入外源性DNA(＞160 ng/mL)能提高整个生物被膜的生物量 (biomass)，而加入 DNA酶 (＞0.03 mg/mL)后生物量则在生物被膜形成后期减少，充分表明eDNA在生物被膜结构组成及形成过程中的作用，是构成白念珠菌生物被膜基质的重要组分。至于eDNA是如何产生的，可能既有菌体裂解后所释放的，也不排除菌细胞主动分泌的。

1.4 脂质

相对于其他成分研究来说，目前基质中脂质成分的研究不多。Conrad等［9］通过超声和阳离子交换技术对两种能进行污水处理的植物标本分析，发现该类标本的EPS中含有1.8%的脂质，后者包括磷脂、糖脂等。白念珠菌生物被膜ECM中的脂质性质及其含量有待于研究。

1.5 水

水在基质中是含量最高的成分，Marshall将生物被膜称为“黏稠的水”(stiff water)。因基质能提供高度水合环境，故比周围环境干燥的速度要慢很多。基质的吸湿性是通过保留水分而并非通过水结合机制完成的［4］。

2 生物被膜基质的功能

与细菌或其他真菌一样，白念珠菌的生物被膜基质也具有多种功能，主要表现在:①介导黏附:黏附是生物被膜形成的第一步，通过基质的黏附使得菌细胞黏附在生物或非生物介质表面从而启动生物被膜形成的早期阶段。②形成并维持生物被膜结构:被膜内菌被基质直接包裹，基质的性质与含量会影响到被膜的三维结构及形成过程。③保护被膜菌并参与耐药:被膜内的基质有助于被膜菌不仅对抗热、紫外线等理化因素的影响，还能对抗机体特异性或非特异性免疫应答、以及药物的杀伤，是导致被膜菌实现免疫逃逸及产生耐药性的重要因素［10］。④具有酶活性:基质中的某些蛋白具有酶活性，能降解细胞外大分子营养物为被膜菌提供营养，并能降解结构性EPS使得细胞从生物被膜中分散出来引发新的定植及感染灶。⑤提供营养:基质EPS被酶降解后所释放的碳源、氮源、磷等化合物可以提供给被膜内菌在营养受限时再利用。⑥其他:促进生物被膜内菌细胞间的基因水平转移;保持水合环境以延长菌细胞在缺水环境中的生存时间等［4］。

3 白念珠菌生物被膜基质的影响因素

白念珠菌生物被膜基质的产生受到诸如生长状态、菌株性质、培养基种类等多种因素影响。Hawser等［11］比较了白念珠菌生物被膜在静止与振摇两种状态下基质的产生，通过检测生物被膜干重、XTT检测代谢及放射性同位素吸收并结合扫描电镜检查等多种方法，证实白念珠菌生物被膜生长及其基质的产生量与菌生长状态密切相关，在动态下被膜生长及其基质产生量要超过静止状态下，且在一定范围内随着摇床转速提高，基质产生量也相应增多。Martins等［8］的实验显示，基质中有关组分含量及比例与菌生长所用的培养基密切相关，eDNA含量、蛋白含量、eDNA/蛋白含量之比以在RPMI-1640培养基中生长的最高，酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基 (YPD培养基)次之，YNB最少。另外，温度等条件也会对基质的组分如多糖、eDNA、蛋白等含量产生影响;同一菌株体内与体外生物被膜基质的产生也会有差异;再者，即使在相同生长条件下，不同菌株因异质性所产生的生物被膜基质也有一定差异。

4 白念珠菌生物被膜基质的调节

白念珠菌生物被膜基质及其一些重要组分的合成受到相应基因或蛋白的调控。

4.1 EFG1 和 BCR1

EFG1和BCR1分别是诱导白念珠菌形态发生和生物被膜形成的转录调节蛋白，Nobile等［2］证实，efg1/efg1与bcr1/bcr1缺失突变株难以形成生物被膜。Harriott等［12］在小鼠阴道接种efg1/efg1突变株，共聚焦显微镜下发现该突变株只能产生酵母相细胞与假菌丝而不能产生基质，故不能形成生物被膜，而互补菌株 (efg1/efg1+p EFG1)的生物被膜形成则恢复到与野生株相似的水平;在阴道的bcr1/bcr1突变株虽然能产生少量假菌丝，但扫描电镜下难以见到基质以及光滑清晰的菌细胞形态，而互补菌株(bcr1/bcr1+p BCR1)则能形成生长旺盛且富含基质的生物被膜。上述结果足见EFG1和BCR1在生物被膜形成以及产生基质过程中的重要作用。

4.2 Zap1

Zap1是白念珠菌锌缺乏反应调节蛋白，参与锌代谢。Nobile等［13］比较了 zap1/zap1缺失突变株、zap1/zap1+p ZAP1互补菌株和ZAP1/ZAP1参考菌株之间的生物被膜及基质形成的异同，结果体内外生物被膜的β-葡聚糖及生物量，zap1/zap1突变株明显高于互补菌株和参考菌株，表明Zap1对于白念珠菌生物被膜及其基质起抑制作用。随后进一步探讨了 Zap1靶基因 (ZRT2，ZRT1，PRA1，CSH1和IFD6)对生物被膜基质主要组分可溶性β-1，3-葡聚糖的调控作用，他们在突变菌株中引入高表达TDH3启动子序列替代上述靶基因的启动子区域，结果证实TDH3-CSH1和TDH3-IFD6两种转化子中的可溶性β-1，3-葡聚糖水平显著下降，其他转化子无明显变化，表明CSH1和IFD6基因为β-1，3-葡聚糖的负调控基因。用同样方法证实了Adh5是 β-1，3-葡聚糖正调控基因。Adh5，Csh1 和Ifd6基因编码乙醇脱氢酶，另两种基因Gca1和Gca2编码葡糖淀粉酶并被证实为β-1，3-葡聚糖的正调控基因。

4.3 Fks1p

Fks1p 是 β-1，3-葡聚糖合成酶，Nett等［14］发现Fks1p所合成的β-1，3-葡聚糖不仅参与白念珠菌细胞壁的结构组成，同时也储积于生物被膜内黏性基质中，使得基质像“海绵”样隔绝药物，阻止药物达到潜在的靶点，保护生物被膜细胞免受药物的干预，故被认为在生物被膜特异性的耐药作用中至关重要。因此，以Fks1p为靶点的棘白菌素类药物若与唑类联用将会协同抗生物被膜。此前，该研究小组［15］观察到，体外和体内生物被膜中的β-1，3-葡聚糖含量比悬浮菌培养物中所检测到的分别升高4～10倍和10倍，因而认为这种基质葡聚糖的检测可以作为白念珠菌生物被膜感染的一个诊断标志。

Nett等［16］不仅发现 Fks1p 通过合成 β-1，3-葡聚糖参与了白念珠菌生物被膜对三唑类耐药性，还进一步探讨了FKS1基因表达对其他抗真菌药敏感性的影响。结果显示，由多西环素诱导所致的FKS1表达下降会提高生物被膜对两性霉素B、阿尼芬净、氟胞嘧啶的敏感性。反之，若FKS1超表达，则会增加生物被膜对阿尼芬净和两性霉素B的耐药性。由此可见，由Fks1p所合成的葡聚糖通过其一定厚度的黏性屏障“隔离”药物而成为白念珠菌生物被膜耐药的机制之一。

4.4 SMI1

Nett等［17］等采用候选基因法探讨蛋白激酶C(PKC)信号通路中相关组分在白念珠菌基质葡聚糖产生和生物被膜耐药性方面的作用，发现PKC通路上游部分组分的突变株即pkc1/pkc1，bck1/bck1，mkc1/mkc1缺失突变株在基质葡聚糖产生方面与参考菌株相比无明显差异，mkk2/mkk2突变株的葡聚糖稍低于参考菌株;该4株突变株生物被膜的耐药性也与参考菌株基本相同。在PKC通路下游组分中，SMI1、RLM1和FKS1对于细胞壁及基质中的葡聚糖合成至关重要，实验中观察到smi1/smi1缺失突变株的基质葡聚糖下降4倍以上，同时对抗真菌药物敏感性也有所提高，而互补菌株smi1/smi1+pSMI1能部分恢复对氟康唑的耐受性，表明Smi1p参与了基质葡聚糖产生及由此所致的生物被膜耐药性。事实上，Smi1p、Rlm1p和Fks1p三种蛋白共同作用产生能“隔绝”药物的生物被膜基质葡聚糖。

4.5 Hsp90

Robbins等［18］发现，分子伴侣蛋白 Hsp90对生物被膜基质有调节作用，在缺乏多西环素状态下，Hsp90缺失突变株的葡聚糖含量为6 000 pg/mL，而以20μg/mL的多西环素抑制Hsp90转录后，葡聚糖含量下降至3 700 pg/mL，具有显著性差异，但多西环素对缺乏四环素操纵子元件tetO启动子的野生型菌株的基质葡聚糖水平不影响。考虑到另一实验中［13］，FKS1/fks1突变株生物被膜基质的葡聚糖水平下降60%时该株生物被膜耐药性消除这一关联因素，可以推定Hsp90缺失导致了葡聚糖含量的下降，所引起约40%的葡聚糖的减少可能促成了对唑类药物的敏感。

随着白念珠菌基因组测序基本完成以及对其生物被膜及基质研究的继续深入，将还会发现有更多的基因及表达产物参与影响生物被膜及基质的形成，以及与生物被膜基质相关耐药性之间的关联。

5 药物对白念珠菌生物被膜基质的干预

既然基质是生物被膜结构的重要组分，因此如能降解基质或抑制其合成，则不失为控制生物被膜的一种有效手段，发挥作用的既有抗生素也有非抗生素类化合物。

卡泊芬净等棘白菌素类抗真菌药是β-1，3-葡聚糖合成酶抑制剂，Soustre等［19］观察到，当白念珠菌生长的培养基中含有亚抑菌浓度(1/2MIC)的卡泊芬净时，白念珠菌黏附到预先包被有基质蛋白的塑料的效果受到影响。结果，在受试的11株白念珠菌株(氟康唑敏感株6株，耐药株5株)中，卡泊芬净对所有氟康唑敏感株的黏附均减少，但对耐药株只有60%(3株)黏附的减少。表明，卡泊芬净对白念珠菌生物被膜发育早期的黏附有抑制作用。

同属棘白菌素类的氨基康定(aminocandidn)也可影响白念珠菌生物被膜细胞形态与代谢。Cateau等［20］研究了亚抑菌浓度 (1/2MIC)的氨基康定对11株白念珠菌的黏附性以及基质蛋白包被对其抑菌效果的影响。结果表明，当黏附的聚苯乙烯介质表面以基质蛋白—基质凝胶 (ECM gel)包被后，氨基康定能明显降低其中10株白念珠菌的黏附;当白念珠菌在含有氨基康定培养基中培养后，6株氟康唑敏感株中有5株的黏附下降;而对于5株氟康唑耐药株，均可观察到对基质包被后的抑制。该实验以及上述Soustre［19］的研究表明，氨基康定和卡泊芬净等棘白菌素类通过影响基质而对生物被膜形成的第一步即黏附阶段产生抑制作用。

Seidler等［21］在连续流动条件下构建了导管生物被膜模型并比较了两性霉素B脂质体(LAMB)、氟康唑、卡泊芬净对白念珠菌生物被膜的清除作用。结果，未用药对照组的24 h生物被膜基质厚度为5～20μm，48 h基质厚度为10～150 μm。经LAMB作用24 h能完全清除其基质 (0 μm)，而氟康唑和卡泊芬净作用24 h后，分别保留10～25μm和10～130μm厚度的基质。从扫描电镜和共聚焦显微镜下所观察到的酵母相细胞、假菌丝及被膜基质三方面来看，0.5μg/mL的LAMB能清除生物被膜，而氟康唑和卡泊芬净则效果较差。

衣霉素为放线菌Streptomyces lysosuperficus产生的核苷酸类抗生素，是包括酵母在内的真核细胞N-糖基化抑制剂，Pierce等［22］采用蛋白质组学和ELISA方法证实，衣霉素处理后的白念珠菌生物被膜基质蛋白糖基化发生缺陷，进而影响了生物被膜的完整性，因而亦提示N-糖基化位点可以成为抗白念珠菌生物被膜的潜在靶点。

Martins等［23］研究了DNase与抗真菌药物联用治疗白念珠菌生物被膜的效应，通过XTT法检测代谢及活细胞计数法证实，DNase能促进白念珠菌生物被膜细胞对抗真菌药物尤其是两性霉素B的敏感性，而对卡泊芬净，尽管DNase能提高其降低线粒体活性的效应，但对活细胞计数则无影响，也不影响生物被膜对氟康唑的敏感性。表明DNase等药通过影响生物被膜结构完整性而成为治疗白念珠菌生物被膜感染的一种辅助手段。

ApoEdpL-W是源于人载脂蛋白E的一个富含色氨酸的 18氨基酸多肽，Rossignol等［24］发现ApoEdpL-W能抑制白念珠菌早期生物被膜，但对晚期成熟生物被膜作用较差，推测可能是ApoEdpL-W对早期生物被膜形成过程中的基质葡聚糖合成有抑制作用，但对成熟生物被膜内的葡聚糖破坏作用较弱。另外，聚氨酯、聚二甲基硅氧烷等医学相关材料用ApoEdpL-W包被则能阻止白念珠菌生物被膜在这些材料上的形成，进一步研究发现其抗白念珠菌作用是依赖于液泡机制来进行的。

金格杆菌(Kingella kingae)为革兰阴性球杆菌，Bendaoud等［25］发现，将该菌所培养的菌苔经离心获得的上清对包括白念珠菌、肺炎克雷伯菌甚至该菌自身在内的多种细菌和真菌生物被膜有抑制作用，经结构分析上清中含两种多糖:一种是与胸膜肺炎放线杆菌荚膜多糖相同的线性多糖;另一种是被称作PAM半乳聚糖的新型线性多糖。后者通过影响生物被膜细胞、基质以及所黏附介质表面的理化性质而发挥其广谱抗生物被膜功能，其生物学活性及潜在的应用价值有待于深入研究。

6 问题与展望

显然，基质或EPS对于生物被膜的重要性不言而喻，可以说，无基质就无生物被膜。目前国内外对铜绿假单胞菌、葡萄球菌等细菌生物被膜基质研究相对来说要多些，而对白念珠菌生物被膜基质研究还远远不够。由于基质不仅涉及生物被膜结构组成，还具有分解酶活性，更重要的是参与了耐药性形成，基质所致耐药性不仅与造成抗菌药物的机械“隔绝”有关，同时还受到多种相关基因表达的调控。鉴于基质在生物被膜形成中的作用，目前已经开始针对基质来设计或筛选破坏生物被膜即以基质为靶点的药物;笔者实验室近期筛选出某些中药有效成分具有抑制生物被膜基质的功效。另外，因为基质是生物被膜的主要组分，故有人建议基质还可作为生物被膜感染诊断的相对特异性标志，当然这种诊断如能成立则会涉及到基质的分离提取(确保相关组分如eDNA等来自生物被膜基质而避免污染有菌细胞裂解释放的成分)、定性定量等多个环节，需不断完善才可成为“生物被膜感染”的诊断依据。相信通过对基质不断深入的研究，不仅丰富了生物被膜的基础理论，同时对于生物被膜相关疾病的诊断与防治也具有积极的临床价值。

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