吴 乔，薛亚平，郑裕国

(浙江工业大学生物工程研究所，浙江 杭州 310014)

腈水解酶是一类能选择性催化腈化合物生成酸和氨的蛋白酶[1，2]，具有来源广泛、反应条件温和、高效专一等特点，常用于工农业生产[3，4]。

R-(-)-扁桃酸是一种重要的手性中间体，具有很好的生物分解性，是目前最受瞩目的酸性光学拆分剂，广泛应用于多种光学活性医药、农药的合成和手性化合物的光学拆分[3]。此外，R-(-)-扁桃酸的新的用途正不断被发掘，市场需求日益增大[5]，其制备越来越受到重视。

R-(-)-扁桃酸的生产方法主要有化学法和生物法，其中生物法中的腈水解酶催化法由于底物价廉、反应条件温和、环境污染小、转化率高、产物光学纯度高，具有良好的工业化前景[1，5]。目前已报道的腈水解酶菌株主要有AlcaligenesfaecalisATCC 8750[6，7]、PseudomonasputidaMTCC 5110[8，9]、Alcaligenessp.ECU0401[10，11]等。构建腈水解酶基因工程菌并进行发酵产酶已成为工业化生产R-(-)-扁桃酸的重要手段。Banerjee等[12]对P.putidaMTCC 5110的腈水解酶基因进行克隆，构建了重组菌E.colipET21b(+)-PspNit，但其摇瓶发酵的生物量较低，单位体积产酶不高。张志钧等利用来自Alcaligenessp.ECU0401的腈水解酶基因重组得到E.coliJM109，优化后，摇瓶生物量为3.13 gdcw·L-1，产酶量达到4760 U·L-1，e.e.值大于95%[13，14]。

Xue等[15，16]通过大规模的筛选和育种，获得一株高活性的立体选择性腈水解酶菌株A.faecalisZJUTB10，并利用该腈水解酶进行了生物催化外消旋扁桃腈生产R-(-)-扁桃酸的研究。用PCR方法扩增出A.faecalisZJUTB10腈水解酶基因，并将其插入到表达载体pET28b(+)中，IPTG诱导后，腈水解酶在大肠杆菌胞内进行了活性表达，具有较高的活性[17]。

作者在此优化了含有A.faecalisZJUTB10腈水解酶基因的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-NIT的培养基组分以及诱导产酶条件，拟为生物法工业化催化扁桃腈生产R-(-)-扁桃酸提供参考。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

产腈水解酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-NIT，目的基因源于A.faecalisZJUTB10，该基因序列全长1068 bp，编码372个氨基酸，预测其分子量为41 548 Da，该序列已提交到GenBank数据库，数据库登记号为HQ407378，自行构建。

扁桃腈(Acros)、扁桃酸(J&K)，其余试剂均为市售分析纯，实验用水为蒸馏水。

高速离心机，美国Beckman Coulter；FA2004型电子分析天平，上海精密仪器仪表有限公司；SPD-20A型高效液相色谱仪，日本岛津公司；Sky-110WX型水浴摇床，上海苏坤有限公司。

1.2 培养基

种子培养基：蛋白胨10 g·L-1，酵母浸出汁5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，卡那霉素50 mg·L-1，121 ℃灭菌20 min。

初始发酵培养基：蛋白胨10 g·L-1，酵母浸出汁5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，pH值7.5，121 ℃灭菌20 min。

1.3 方法

初始培养方法：从甘油管或斜面挑取重组工程菌至装液量为50 mL (250 mL三角瓶)的种子培养基中，37 ℃培养12 h后，取1 mL种子液于装液量为100 mL(500 mL三角瓶)的发酵培养基中，37 ℃培养4 h后加诱导剂乳糖2.0 g·L-1，转入28 ℃诱导培养16 h后离心收集菌体。

转化方法：将菌体用生理盐水(0.85%)洗涤，称取0.05 g菌体悬浮于10 mL(pH值8.5)Tris-HCl缓冲溶液中(测产酶时取1 mL发酵液离心，收集菌体，生理盐水洗涤后悬浮于5 mL缓冲溶液中)，加入底物R，S-扁桃腈(终浓度50 mmol·L-1)，35 ℃、180 r·min-1下反应20 min，立即取样1 mL，12 000 r·min-1离心6 min终止反应，取上清液，检测产物和底物的浓度。

1.4 分析检测

1.4.1 生物量的测定

取30 mL发酵液离心收集菌体，并用生理盐水(0.85%)洗涤，90 ℃烘干至恒重，即为发酵液的生物量，以gdcw·L-1计。

1.4.2 酶活的测定

产物和底物浓度的检测：色谱柱为Hypersil ODS(250 mm×4.6 mm，填料粒径5 μm)，流动相为甲醇∶NH4H2PO4(50 mmol·L-1)=35∶65 (体积比)，柱温 35 ℃，流速1 mL·min-1，检测波长228 nm。

酶活力定义为：每分钟催化生成1 μmolR-(-)-扁桃酸所需的酶量为1个酶活力单位(U)。

1.4.3 产物对映体过量值的测定

将转化样品用浓盐酸调pH值至1.5，加入等体积乙酸乙酯萃取，收集有机相，风干，干燥后将白色晶体溶解于流动相正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸(90∶10∶0.1)，用于色谱分析。色谱柱为CHIRALEL-OD-H手性柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm；Daicel Chemical Industries，Japan)，柱温40 ℃，流速0.8 mL·min-1，检测波长228 nm。R-(-)-扁桃酸的光学纯度通过计算对映体过量值(e.e.值)来评价。

式中：cR和cS分别为R型和S型异构体的浓度。

2 结果与讨论

2.1 碳源对重组菌产酶的影响

以初始发酵培养基为基础，考察不同碳源对菌株生长和产酶的影响，结果见表1。

表1 碳源对菌株生长和产酶的影响

由表1可知，碳源为甘油、葡萄糖、麦芽糖和甘露醇时，在乳糖诱导下，酶活很低或者没有；碳源为玉米浆粉时比酶活和产酶量最高，分别达到约209.19 U·g-1、2275.99 U·g-1，生物量较高，约为2.72 gdcw·L-1。综合考虑，选择最佳碳源为玉米浆粉。

玉米浆粉浓度对菌株生长和产酶的影响见图1。

图1 玉米浆粉浓度对菌株生长和产酶的影响

由图1可知，玉米浆浓度为10 g·L-1时比酶活最高，但生物量不高；玉米浆粉浓度为25 g·L-1时，产酶量最高，达2505.39 U·L-1；考虑到产酶，选择最佳玉米浆粉浓度为25 g·L-1。

2.2 氮源对重组菌产酶的影响

以初始发酵培养基为基础，考察不同氮源对菌株生长和产酶的影响，结果见表2。

表2 氮源对菌株生长和产酶的影响

由表2可知，氮源为酵母浸出汁时，比酶活有明显优势，产酶量也最高。因此，选择最佳氮源为酵母浸出汁。

酵母浸出汁浓度对菌株生长和产酶的影响见图2。

图2 酵母浸出汁浓度对菌株生长和产酶的影响

由图2可知，选择最佳酵母浸出汁浓度为5 g·L-1，比酶活和产酶量均最高，分别为210.29 U·g-1和2458.76 U·L-1。

2.3 磷酸盐对重组菌产酶的影响

以初始发酵培养基为基础，考察不同磷酸盐对菌株生长和产酶的影响，结果见图3。

1.K2HPO4 2.KH2PO4 3.Na2HPO4 4.NaH2PO4 5.(NH4)2HPO4 6.NH4H2PO4 7.Control

由图3可知，KH2PO4、NaH2PO4、NH4H2PO43种磷酸盐对比酶活有促进作用，分别为262.67 U·g-1、245.27 U·g-1、244.60 U·g-1(对照样比酶活为234.15 U·g-1)，说明含2个氢离子的磷酸盐利于腈水解酶的表达，但是磷酸盐的加入减少了生物量，抑制了产酶。

至此，我终于明白了。她所谓的“怕”，其实是面对弱者的遭遇无力提供帮助而产生的自责，继而形成的逃避行为。

2.4 金属离子对重组菌产酶的影响(表3)

表3 金属离子对菌株生长和产酶的影响

由表3可知，Cu+、Mg2+(MgCl2·6H2O)、Fe3+、Fe2+、Al3+、Ca2+对相对酶活有促进作用，对生物量影响不一，Fe3+、Fe2+有利于菌株产酶(分别提高3.71%和2.45%)，由于Fe2+在空气中容易被氧化成Fe3+，可认为Fe3+促进了菌株产酶。

Fe3+浓度对菌株生长和产酶的影响见图4。

图4 Fe3+浓度对菌株生长和产酶的影响

由图4可知，选择最佳Fe3+浓度为0.5 mmol·L-1，比酶活和产酶量最高，分别为252.49 U·g-1和2502.89 U·L-1。

2.5 诱导剂乳糖浓度对重组菌产酶的影响(图5)

图5 乳糖浓度对菌株生长和产酶的影响

由图5可知，随着乳糖浓度的增大，菌株生物量上升，比酶活和产酶量呈现先升后降的趋势。选择最佳乳糖浓度为0.5 g·L-1，比酶活和产酶量最高，分别为340.91 U·g-1和3262.84 U·L-1。

2.6 诱导温度对重组菌产酶的影响(图6)

图6 诱导温度对菌株生长和产酶的影响

由图6可知，随着诱导温度的升高，比酶活和产酶量呈现先升后降的趋势，在30 ℃时最高，分别为352.06 U·g-1和3791.12 U·L-1；菌株生物量呈现先升后降再升的趋势，在30 ℃时最高，而后下降，超过35 ℃时，又缓慢回升。综合考虑，选择最佳诱导温度为30 ℃。

2.7 乳糖加入时间对产酶的影响(图7)

图7 乳糖加入时间对菌株生长和产酶的影响

由图7可知，随着乳糖加入时间的延后，比酶活和产酶呈现先升后降的趋势，在乳糖加入时间为6 h时最高，分别为368.04 U·g-1和3880.50 U·L-1；菌株生物量呈现先降后升再降的趋势。综合考虑，选择最佳乳糖加入时间为6 h。

2.8 重组菌产酶过程(图8)

自诱导剂加入后开始计时，不同时间取样分析检测诱导过程中pH值、比酶活、生物量以及产酶量的变化，见图8。

图8 加入乳糖后发酵过程中菌株生长和产酶的变化

由图8可知，随着诱导时间的延长，pH值没有明显变化，生物量一直呈上升趋势，比酶活在16 h时达到最高368.92 U·g-1，其后急剧下降。从产酶出发考虑，选择最佳诱导时间为28 h，其生物量、比酶活以及产酶量分别为5.27 gdcw·L-1、297.15 U·g-1和6161.46 U·L-1。

2.9 重组菌腈水解酶不对称催化转化外消旋型扁桃腈生成R-(-)-扁桃酸

以最优培养条件下获得的菌体催化外消旋型扁桃腈生成R-(-)-扁桃酸，结果见图9。

图9 菌体催化扁桃腈生成R-(-)-扁桃酸的过程

由图9可知，初始底物浓度为47.77 mmol·L-1，转化50 min后产物浓度为43.96 mmol·L-1，转化率达92.02%，产物e.e.值达99%以上，表明该酶的立体选择性很严格。

3 结论

对于重组菌E.coliBL21 (DE3)/pET28b(+)-NIT产腈水解酶，最适发酵培养基为：玉米浆粉25 g·L-1，酵母浸出汁5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，Fe3+0.5 mmol·L-1，初始pH值7.5；最适诱导产酶条件为：诱导剂乳糖0.5 g·L-1，诱导剂加入时间为接种6 h后，诱导温度30 ℃，诱导时间28 h。在该条件下，产酶量达到6161.46 U·L-1，所得菌体用于不对称转化R，S-扁桃腈生成R-(-)-扁桃酸，转化率达92.02%，产物e.e.值达99%以上。该菌株十分有潜力作为R-(-)-扁桃酸工业生产的生物催化剂。

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