韩春蕃 陈莹蓉 蔡炜龙(等）

[摘要] 目的 探讨IGF—ⅠR信号通路在西妥昔单抗抗HepG2细胞增殖中的作用。 方法 选用浓度递增的西妥昔单抗（5～500） mg/mL、胰岛素样生长因子（IGF）（2.5～250） μmol/L及其抑制剂aIR3（2.5～250） μmol/L，单独或联合作用于HepG2细胞，观察IGF与aIR3对西妥昔单抗抗HepG2增殖的影响。 结果 细胞培养72 h后，单药西妥昔单抗对HepG2细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性，西妥昔单抗联合aIR3组增殖抑制率在相应浓度下均显著高于同浓度的西妥昔单抗组（均为P < 0.01），IGF（10～250） μmol/L与西妥昔单抗（20～500） mg/mL联合组增殖抑制率均显著低于相应浓度的西妥昔单抗组（均为P < 0.01）。 结论 IGF—ⅠR通路可影响西妥昔单抗抗HepG2细胞增殖的作用，可能是肝癌细胞株对西妥昔单抗耐药的机制之一。

[关键词] 肝癌细胞株；表皮生长因子受体；西妥昔单抗；胰岛素样生长因子—Ⅰ受体

[中图分类号] R735.7[文献标识码] A[文章编号] 1673—9701（2012）25—0002—03

Role of IGF—ⅠR signaling pathway in the anti—proliferation of cetuximab to HepG2 cells

HAN Chunfan1 CHEN Yingrong2 CAI Weilong1 XIE Zhonghai1 WANG Yan1 SHEN Hua1 MIN Lishan2 WEI Feng1 DAI Licheng2

1.Department of Surgery， Huzhou Central Hospital， Huzhou 313000， China； 2.Huzhou Key Laboratory of Molecular Medicine， Huzhou 313000， China

[Abstract] Objective To investigate the role of IGF—ⅠR signaling pathway in the anti—proliferation of cetuximab to HepG2 cells. Methods Increasing concentrations of cetuximab （5—500） mg/mL， insulin—like growth factor （IGF） （2.5—250） μmol/L and its inhibitor aIR3 （2.5—250） μmol/L， alone or in combination were administrated to HepG2 cells. The inhibitory effects of the drugs on cell proliferation were observed. Results After 72 h cell culture， the single agent of cetuximab inhibited the proliferation of HepG2 cells in a dose—dependent manner. The growth inhibition rates of cetuximab combined aIR3 group at the corresponding concentrations were significantly higher than that of cetuximab group （all P < 0.01）. However， the proliferation inhibition rates of IGF （10—250） μmol/L combined cetuximab （20—500） mg/mL were significantly lower than that of cetuximab group （all P < 0.01）. Conclusion IGF—ⅠR pathway can affect the anti—proliferation of cetuximab to HepG2 cells， which may be one of the mechanisms of hepatocellular carcinoma cell lines resistance to cetuximab.

[Key words] Hepatocellular carcinoma cell lines； Epidermal growth factor receptor； Cetuximab； Insulin—like growth factor—Ⅰ receptor

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，恶性程度与死亡率均很高。外科手术是其主要治疗方法，但术后易复发转移，传统的放、化疗疗效不佳，因此总体临床疗效不满意。生物靶向治疗为恶性肿瘤提供了新的治疗手段。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）几乎在所有实体瘤中均有表达。肝癌细胞中同样有EGFR的过表达，并常与肝癌侵袭、转移、放化疗抗性等生物学特性有密切关系。研究发现，EGFR抑制剂如西妥昔单抗对肝癌细胞具有明显的体内外抑制作用[1]。但部分患者对此类药物无明显效果，部分患者最终产生耐药，尽管机制并不完全明确[2]，其中胞内许多不同信号通路的改变是产生耐药性的重要机制，而胰岛素样生长因子—Ⅰ受体（insulin—like growth factor—Ⅰreceptor，IGF—ⅠR）通路则是其中重要的信号通路[3]。本文通过在西妥昔单抗抑制人肝癌细胞株HepG2增殖的实验体系中，分别加入促进或抑制IGF—ⅠR信号通路的试剂，探讨IGF—ⅠR信号通路在前者中的作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

西妥昔单抗、IGF—ⅠR抑制剂aIR3与IGF均购自德国默克制药公司，CCK—8细胞计数试剂盒产自日本同仁化学研究所，RPMI—1640细胞培养液、10%新生小牛血清、含100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的双抗、0.25%胰酶溶液购自美国Gibco公司，分析纯二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司。

1.2 细胞培养

人肝癌细胞株HepG2购自中科院上海细胞所，细胞培养液为含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI—1640培养液，培养于37℃、5%CO2、85%湿度的培养箱，每3～4天传代1次，细胞于对数生长期时开始实验。

1.3 细胞生长抑制实验

分为5组，包括空白对照组、细胞对照组、西妥昔单抗组、IGF和西妥昔单抗联合组、aIR3和西妥昔单抗联合组，每组设3个复孔。HepG2细胞用0.25%胰酶溶液消化，用RPMI—1640培养液稀释并接种于96孔培养板，使其密度为3×104/mL，置于恒温箱中培养。西妥昔单抗单用时选取7个依次递增的浓度[（5～500）mg/mL]处理细胞，两药联用时，按照药物联合作用实验原则，加入孔内的药物浓度亦同时递增，且两药间浓度比例保持恒定[西妥昔单抗（5～500）mg/mL，IGF（2.5～250）μmol/L，aIR3（2.5～250）μmol/L]。分别培养24 h、48 h、72 h，应用全自动酶标仪测定各孔吸光度值（A值），并计算细胞增殖抑制率。

1.4 统计学方法

计算各组细胞增殖抑制率均数，以均数±标准差（x±s）表示，采用双侧t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 西妥昔单抗单药或联合aIR3对HepG2细胞增殖的影响

西妥昔单抗单药或联合aIR3与HepG2细胞培养72 h后，单药与联合组的增殖抑制率均随剂量增加而升高，但在相应浓度下，西妥昔单抗联合aIR3组增殖抑制率均显著高于同浓度的西妥昔单抗组（均为P < 0.01），见表1、图1，提示aIR3可协同西妥昔单抗对HepG2细胞的增殖抑制作用。

2.2 西妥昔单抗单药或联合IGF对HepG2细胞增殖的影响

西妥昔单抗单药或联合IGF与HepG2细胞培养72 h后，西妥昔单抗单药组的增殖抑制率随剂量增加而升高，二药联合组增殖抑制率无显著变化。IGF在（10～250）μmol/L浓度范围内，西妥昔单抗在（20～500）mg/mL浓度范围内，两药联合组增殖抑制率均显著低于相应浓度的西妥昔单抗组（均为P < 0.01），见表2、图2，表明IGF可拮抗西妥昔单抗对HepG2细胞的增殖抑制作用。

3 讨论

近年来，分子靶向治疗技术的飞速发展为肝癌提供了一个新的治疗途径，随着国内外研究的不断深入，涌现出了许多针对不同细胞表面分子的新型靶向治疗药物，而EGFR抑制剂则是最受关注的领域之一。EGFR属受体酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）erbB/HER家族。它含有3个结构域：胞外受体结合区、跨膜区及含酪氨酸激酶结构域的胞内区。受体结合相应配体后发生二聚化，使细胞内酪氨酸残基发生磷酸化，进而募集并活化信号复合体，激活其下游信号转导蛋白。对肿瘤细胞的生物学作用包括调节侵袭、转移、血管生成、生长及转化。EGFR高表达见于多种恶性肿瘤，且EGFR高表达的恶性肿瘤患者预后不良[4]。肝癌细胞中也常有EGFR的表达，并与肝癌患者的临床分期、肝内外转移及组织分化程度等有关[5]。

目前已成功开发出可用于临床治疗的两类EGFR抑制剂，包括小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI）与单克隆抗体（mAb）[6]。mAb通过竞争性地与相应配体结合，阻止该配体与受体结合，从而抑制后者酪氨酸激酶的激活与下游信号通路的活化。TKI与EGFR结合后，可阻断ATP与TK结构域的结合，使其受体无法磷酸化，信号传导通路中断，但不引起EGFR内化[7]。大量临床前研究及临床资料证实，EGFR抑制剂能够有效抑制肿瘤增殖。但EGFR抑制剂在临床应用中已出现了耐药现象，其产生耐药的机制仍未完全明确，其中绕开EGFR通路的其他TK受体的活化被认为是产生耐药性的重要机制，而IGF—ⅠR通路则是一条重要旁路[3，7]。

胰岛素样生长因子Ⅰ型受体（IGF—ⅠR）在多种细胞广泛表达，对调节正常细胞的多种生物学功能起关键作用。但其过度表达可使细胞向恶性转化，已见于多种恶性肿瘤。IGF—ⅠR介导的信号通路在促有丝分裂活性、细胞恶性转化外、抗细胞凋亡等方面有重要作用。IGF—ⅠR单克隆抗体aIR3对肿瘤的抑制作用已有不少报道[8]。aIR3可通过阻滞细胞于G0/G1期、诱导细胞凋亡等作用抑制肝癌细胞增殖。此外，aIR3除可抑制IGF—ⅠR功能及其下游丝氨酸/苏氨酸Akt的磷酸化，还可通过溶酶体依赖与非依赖途径降解IGF—ⅠR[9]。aIR3封闭IGF—ⅠR，在体外可消除IGF—ⅠR促增殖、抑制凋亡的作用，从而抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，达到治疗目的。

在本组资料中，EGFR抑制剂西妥昔单抗作用于人肝癌细胞株HepG2后，对其增殖抑制作用呈现明显的剂量依赖性，在此基础上加入不同浓度的IGF—ⅠR抑制剂aIR3后，二者对HepG2细胞增殖的抑制率呈现出明显的协同作用。但在加入（10～250）μmol/L IGF后，则明显拮抗西妥昔单抗对HepG2细胞的增殖抑制作用。表明IGF—ⅠR通路可影响西妥昔单抗抗HepG2细胞增殖的作用，这可能是肝癌细胞株对西妥昔单抗耐药的可能机制之一。但IGF—ⅠR与EGFR下游信号通路如何相互影响导致西妥昔单抗耐药的详细机制还需进一步深入研究。

[参考文献]

[1]吕汪霞，马胜林. 西妥昔单抗的临床研究新进展[J]. 医学综述，2010，16（9）：1345—1348.

[2]Jalal S，Waterhouse D，Edelman MJ，et al. Pemetrexed plus cetuximab in patients with recurrent non—small cell lung cancer （NSCLC）： a phase Ⅰ/Ⅱ study from the Hoosier Oncology Group[J]. J Thorac Oncol，2009，4（11）：1420—1424.

[3]Chakravarti A，Loeffler JS，Dyson NJ. Insulin—like growth factor receptor Ⅰ mediates resistance to anti—epidermal growth factor receptor therapy in primary human glioblastoma cells through continued activation of phosphoinositide 3—kinase signaling[J]. Cancer Res，2002，62（1）：200—207.

[4]Rubin Grandis J，Melhem MF，Gooding WE，et al. Levels of TGF—α and EGFR protein in head and neck squamous cell carcinoma and patient survival[J]. J Natl Cancer Inst，1998，90（11）：824—832.

[5]徐立，张昌卿，冯凯涛，等. 肝细胞癌及癌旁肝组织EGFR和EGFR vⅢ的表达及其临床意义[J]. 中山大学学报（医学科学版），2006，27（4）：467—471.

[6]Mendelsohn J，Baselga J. Epidermal growth factor receptor targeting in cancer[J]. Semin Oncol，2006，33（4）：369—385.

[7]王洪波，陈晓光. EGFR抑制剂耐药机制研究的新进展[J]. 国际药学研究杂志，2007，34（5）：347—350，355.

[8]Hailey J，Maxwell E，Koukouras K，et al. Neutralizing anti—insulin—like growth factor receptor 1 antibodies inhibit receptor function and induce receptor degradation in tumor cells[J]. Mol Cancer Ther，2002，1（14）：1349—1353.

[9]Lu Y，Zi X，Zhao Y，et al. Insulin—like growth factor—Ⅰ receptor signaling and resistance to trastuzumab （Herceptin）[J]. J Natl Cancer Inst，2001，93（24）：1852—1857.

（收稿日期：2012—05—08）