陈盛强罗学港杨泉曹开谊孙卫文陈希张维雯黄越玲刘国彬沈岩松戴丽军易咏红

·论 著·

GSK3抑制剂氯化锂对脆性X综合征模型小鼠避暗行为的干预作用☆

陈盛强*△罗学港*杨泉*△曹开谊△孙卫文△陈希△张维雯※黄越玲△刘国彬△沈岩松△戴丽军△易咏红△

【摘要】目的 探讨糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase3，GSK3）抑制剂氯化锂对脆性X综合症小鼠模型的避暗行为的干预作用及机制。方法 通过对30日龄脆性X综合症小鼠连续腹腔注射不同剂量氯化锂5 d，用药第4天和第5天进行避暗实验；同时用免疫印迹技术检测Fmr1 knockout（KO）及 wild type（WT）小鼠的海马和皮层总GSK 3β和磷酸化GSK 3β（P-GSK3β）的变化。结果 在避暗实验中，KO鼠与 WT鼠，两者潜伏期及错误次数分别为（56±32）s，（83±24）s；（7±3）次，（3±2）次；免疫印迹实验结果：KO鼠皮层及海马 P-GSK3β表达平均灰度值分别为 69，63；WT鼠皮层和海马均为 100。注射氯化锂后，KO鼠和 WT鼠总GSK3β无明显改变，而KO鼠60 mg／kg，120 mg／kg，200 mg／kg组皮层P-GSK3β表达平均灰度值分别为：147，151，234；海马P-GSK3β分别为108，111，146，较空白组增多；P＜0.05。WT鼠用氯化锂后，潜伏期和错误次数以及P-GSK3β表达变化无统计学意义。 结论 氯化锂能改善KO鼠的学习记忆能力，可能与氯化锂导致的P-GSK3β的表达增加有关，对脆性X综合征基因敲除小鼠有治疗作用。

【关键词】脆性X综合症 FMR1基因敲除 避暗实验GSK3β 磷酸化GSK3β 氯化锂

脆性X综合症（fragile X syndrome，FXS）是最常见的遗传性智力低下疾病之一，它是由X连锁的FMR1基因5′端（CGG）n三核苷酸重复序列异常扩增及其相邻部位的CpG岛异常甲基化，使其编码产物FMRP（fragile X mental retardation protein）不能正常表达所致［1］，研究还发现Fmr1基因敲除小鼠脑GSK3的活性异常，锂是GSK3的抑制剂，是否能改善KO小鼠的异常表型。本实验通过避暗实验，观察Fmr1基因敲除小鼠的学习记忆能力变化，同时观察使用氯化锂后小鼠学习记忆的改善情况，并采用免疫印迹技术检测鼠脑GSK3β和P-GSK3β表达变化，探讨GSK3抑制剂氯化锂是否能改善KO小鼠的学习能力及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与用药处理 Fmr1基因敲除型（KO）纯合子（－／－）及其野生型（WT）纯合子（＋／＋）FVB近交系小鼠由荷兰伊拉斯塔斯大学细胞生物学及遗传学研究中心Oostra BA教授惠赠，广州医学院实验动物中心饲养及繁殖。所有实验动物的操作及饲养均符合广东省及广州医学院实验动物管理饲养条例，遵循人道原则。实验动物选用30日龄组，不分雌雄，分为KO和WT两大组。KO及WT每组又分为6小组：空白对照组（0组）：腹腔注射生理盐水（NS）；以及5个用药组：分别腹腔注射30 mg／kg、60 mg／kg、90 mg／kg、120 mg／kg、200 mg／kg氯化锂。每组15只，共180只小鼠。6个实验小组分别对应的血锂浓度分别是：对照组：0 mmol／L、实验组：0.71 mmol／L、1.42 mmol／L、2.13 mmol／L、2.84 mmol／L［2］、4.73 mmol／L。血锂浓度中2.84 mmol／L对应120 mg／kg氯化锂是从参考文献［3］中获得，其余均为对应按比例稀释得出。所有小鼠使用前做基因鉴定，确保小鼠的品种为KO鼠或WT鼠；每一窝KO或WT小鼠，每次均采用随机分组的方法，分成6个实验组；所有的小鼠连续5 d腹腔注射氯化锂（Sigma），第4天、第5天打药30 min后做避暗试验；第6天打药30 min后取脑组织，海马及皮层做蛋白免疫印迹实验，所有的小鼠均在上午9：00至12：00试验。

1.2 基因型鉴定 实验动物的基因型鉴定参照文献［4］。

1.3 避暗实验 实验方法参照文献［4］。

1.4 组织制备与蛋白免疫印迹分析 小鼠第6天打药30 min后，脱臼断头取脑，冰上分离取大脑皮层和海马，按照100 mg组织加入1000 μL全细胞裂解液，10 μL的PMSF（苯甲基磺酰氟（Phenylmehanesulfonyl fluoride，PMSF））、10 μL的磷酸酶抑制剂（三种试剂均购于广州美津生物公司），用手持式匀浆器匀浆，低温离心机4℃，14 000 g离心5 min，取上清液。GSK3β和P-GSK3β（cell signaling technology），蛋白免疫印迹检测：检测GSK3β取15 μg全细胞蛋白，检测P-GSK3β时取45 μg全细胞蛋白，蛋白提取液与Sample buffer（10%SDS）混合，沸水煮5 min，两种抗体均用10%的SDS-PAGE进行电泳分析，电泳结束后转膜。转膜后进行免疫印迹杂交反应。步骤如下：5%的脱脂奶粉封闭1 h；分别与GSK3β（1∶6000稀释）和P-GSK3β（1∶2000稀释）一抗杂交反应4℃过夜；加二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H＋L）（碧云天）室温杂交反应 1 h；加入ECL反应4 min后，暗室X胶片曝光，显影和定影。免疫印迹用光密度法（quantity One）定量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件分析所有结果均用（±s）表示；避暗实验中的同一组实验前后两天的比较采用配对t检验；避暗实验中KO与WT鼠同一天实验采用独立样本t检验；避暗实验中KO或WT鼠同一天实验6种用药剂量间比较采用单因素方差分析；蛋白印迹实验中KO与WT鼠的比较采用独立样本t检验，同一种鼠用药剂量间的比较用单因素方差分析，检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 小鼠DNA鉴定结果 KO和WT小鼠基因PCR扩增结果如图1所示。经PCR在KO小鼠扩增出约为800 bp的DNA片断；在WT小鼠扩增出约为468 bp的DNA片断。

2.2 避暗实验 第1天是学习阶段，错误次数比WT鼠多（P＜0.05），而避暗潜伏期没有差异（P＞0.05）；第2天是检测小鼠记忆能力，KO鼠避暗潜伏期明显比WT鼠减小，错误次数比WT鼠多（P＜0.05），提示与WT鼠比较，KO鼠的学习记忆有缺陷的。

图2～3为KO鼠和WT鼠分别用药氯化锂腹腔注射5 d后，不同剂量间对小鼠学习记忆行为的改善作用。KO鼠用药氯化锂的5个不同剂量后，与对照组生理盐水比较，KO鼠用药120 mg／kg和200 mg／kg组避暗潜伏期有明显升高 （P＜0.05），避暗错误次数有明显下降（P＜0.05）。用5种氯化锂的剂量给WT鼠用药，发现90 mg／kg、120 mg／kg和200 mg／kg组使WT鼠的避暗潜伏期有所升高，但没有明显的统计学意义（P＞0.05），避暗错误次数也没有明显的改变 （P＞0.05），提示氯化锂对WT鼠没有改善作用。

2.3 免疫印迹实验结果 见图4（A～F）。图A显示，在小鼠的皮层和海马，KO鼠的蛋白P-GSK3β表达量比WT鼠少，差异有统计学意义（P＜0.05）；图B显示，KO鼠皮层和海马的GSK3β表达量与WT鼠比较，没有显著差异（P＞0.05）。图C，D为KO鼠使用4种不同剂量的氯化锂 （0 mg／kg、60 mg／kg、120 mg／kg、200 mg／kg）用药后，皮层和海马蛋白 PGSK3β、GSK3β表达的改变，由图可见，用药后，与对照组0 mg／kg（即生理盐水组）比较，P-GSK3β在皮层和海马的表达，有统计学意义的升高 （P＜0.05）；GSK3β的改变不明显，没有明显统计学意义 （P＞0.05）。图E，图F分别是给氯化锂0 mg／kg组和120 mg／kg组，用药后两种蛋白（P-GSK3β与GSK3β）在WT鼠脑组织（皮层与海马）的表达。由图可见，给氯化锂120 mg／kg组与对照组0 mg／kg（生理盐水）组比较，P-GSK3β的表达上升，有统计学意义 （P＜0.05）；GSK3β表达没有明显改变，（P＞0.05）。

3 讨论

到目前为止脆性X综合症还没有找到有效的治疗药物。近些年的研究提出锂可能对FXS有治疗作用［5］。这就给我们很好的启示，因为锂作为情绪稳定剂已经在人类使用了多年，其作用机理可能对GSK3的抑制［6］，人们对它的药物代谢动力学，安全性和耐受性都很了解［7］。因此，进一步的研究主要是应用锂剂后GSK3的变化和KO鼠特有性状表型的变化的关系。Min WW等［3］报告，在Fmr1基因敲除小鼠，P-GSK3表达是减少的，GSK3的活性是增高的。Yuskaitis等［8］报告用GSK-3抑制剂氯化锂能改善Fmr1 KO小鼠的特有表型，使KO鼠旷场试验的活动性降低。

我们实验发现，KO鼠避暗潜伏期比WT鼠小，错误次数比WT鼠多（P＜0.05），提示KO鼠的学习记忆有缺陷的。使用连续5 d的氯化锂治疗后，KO鼠的避暗潜伏期增加，错误次数减少，其中120 mg／kg和200 mg／kg剂量组有明显统计学意义，提示120 mg／kg和200 mg／kg的氯化锂对KO鼠的学习记忆有改善作用。而对于WT鼠，避暗潜伏期和避暗错误次数用药后没有明显改变。这些结果表明氯化锂用药后对KO鼠的学习记忆改善明显，对WT鼠没有明显改善，而且在氯化锂的治疗窗内，药物作用与用药浓度的增加是成正相关的。

图1 KO和WT小鼠FMR1基因片断PCR扩增结果

表1 KO和WT小鼠避暗实验结果（±s，n＝15）

表1 KO和WT小鼠避暗实验结果（±s，n＝15）

1）与WT鼠比较，P＜0.05

潜伏期（s） 错误次数（次／5 min）鼠种WT KO第1天29±16 26±12第2天83±24 56±321）第1天8±2 12±31）第2天3±2 7±31）

图2 避暗实验中KO及WT小鼠各氯化锂用药组的潜伏期。a：KO鼠对比WT鼠，P＜0.05。

图3 避暗实验中KO及WT小鼠各氯化锂用药组的错误次数。a：KO鼠对比WT鼠，P＜0.05

图4 免疫印迹实验结果。A：WT与KO鼠蛋白P-GSK3β比较；B：WT与KO鼠蛋白GSK3β比较； 图C：给氯化锂4种不同剂量后P-GSK3β在KO鼠皮层的表达； D：给氯化锂4种不同剂量后GSK3β在KO鼠海马的表达；E：氯化锂0 mg／kg组和120 mg／kg组用药后P-GSK3β在WT鼠皮层的表达；F：氯化锂0 mg／kg组和120 mg／kg组用药后GSK3β在WT鼠海马的表达。

我们检测了溶媒对照组的KO和WT鼠的PGSK3β和GSK3β的表达，结果发现，在小鼠的皮层和海马，KO鼠的蛋白P-GSK3β表达量比WT鼠少，差异有统计学意义（P＜0.05）；而总GSK3β表达量与WT鼠相比无显著差异（P＞0.05），从而证实KO鼠GSK3的抑制受损。与Yuskaitis等［8］的研究结果相一致 。推测在FVB Fmr1 KO鼠的脑区，皮质和海马，由于GSK3β丝氨酸磷酸化减少，而导致GSK3β的抑制性调节异常。KO和WT鼠腹腔注射氯化锂6 d后，分别取皮层和海马观察用药后P-GSK3β表达量变化。结果发现，4种不同剂量的氯化锂均能增加KO鼠皮层和海马的P-GSK3β的表达量，具有剂量依赖效应，而对总的GSK3β表达量改变不明显，提示小鼠的学习记忆改善可能与P-GSK3β表达升高有关，KO鼠的GSK3丝氨酸磷酸化缺陷可以通过锂增加GSK3磷酸化水平来调节，与Min WW等2009年的研究结果一致。

我们的实验是对前人在果蝇［9］和C57BL／6J× FVB／NJ Fmr1 KO鼠［3］实验的一个补充和延伸；已经有文献证实GSK3与FXS的mGluR学说有关［10］，因为mGluR拮抗剂MPEP能增加KO鼠的GSK3磷酸化［8］，而在WT鼠没有，这提示升高的mGluR信号对GSK3的活性是起作用的。我们应用氯化锂处理KO鼠得出的结果正好与前人用MPEP处理的结果相符，这说明氯化锂也可能是通过mGluR途径来起作用，但具体的机制仍需进一步探讨。锂能够恢复KO鼠的异常行为补充了锂可能对FXS病人提供治疗益处的学说。因此，锂可能对FXS病人的治疗起作用。

参考文献

［1］Garber K，Smith KT，Reines D，et al.Transcription，translation and fragile X syndrome［J］.Curr Opin Genet Dev，2006，16（3）：270－275.

［2］Crawford DC，Zhang F，Wilson B，et al.Fragile X CGG repeat structures among African-Americans： identification of a novel factor responsible for repeat instability［J］.Hum Mol Genet，2000，9（12）：1759－1769.

［3］Min WW，Yuskaitis CJ，Yan Q，et al.Elevated glycogen synthase kinase-3 activity in Fragile X mice：key metabolic regulator with evidence for treatment potential［J］.Neuropharmacology，2009，56（2）：463－472.

［4］ 邢州，孙卫文，黄月玲，等.使用PCR方法检测Fmr1基因敲除小鼠基因型［J］.现代医院，2009，9（5）：12－14.

［5］Berry-Kravis E，Sumis A，Hervey C，et al.Openlabel treatment trial of lithium to target the underlying defect in fragile X syndrome［J］.J Dev Behav Pediatr，2008，29（4）：293－302.

［6］Jope RS，Roh MS.Glycogen synthase kinase-3（GSK3）in psychiatric diseases and therapeutic interventions［J］.Curr Drug Targets，2006，7（11）：1421－1434.

［7］Jope RS.Anti-bipolar therapy： mechanism of action of lithium［J］.Mol Psychiatry，1999，4（2）：117－128.

［8］Yuskaitis CJ，Mines MA，King MK，et al.Lithium ameliorates altered glycogen synthase kinase-3 and behavior in a mouse model of fragile X syndrome［J］.Biochem Pharmacol，2010，79（4）：632－646.

［9］McBride SM，Choi CH，Wang Y，et al.Pharmacological rescue of synaptic plasticity， courtship behavior， and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome［J］.Neuron，2005，45（5）：753－764.

［10］Bear MF，Huber KM，Warren ST.The mGluR theory of fragile X mental retardation［J］.Trends Neurosci，2004，27（7）：370－377.

（责任编辑：李立）

☆ 广东省自然科学基金项目（编号：815101700100005），广东省科技计划项目（编号：2008B030301371，2009B030801368）

* 中南大湘雅医学院人体解剖学和神经生物学系 （长沙 410013）

△ 广州医学院第二附属医院

※ 广州医学院第三附属医院

【中图分类号】R742

【文献标识码】A

收稿日期：（2011－05－31）

doi：10.3969／j.issn.1002－0152.2012.08.009

通讯作者（E-mail：chenshengq66＠gmail.com）

Theraputic effects of lithium chloride on passive avoidance behavior in a mouse model of Fragile X Syndrome.

CHEN Shengqiang，LUO Xuegang，YANG Quan，CAO Kaiyi，SUN Weiwen，CHEN Xi，ZHANG Weiwen，HUANG Yueling，LIU Guobin，SHEN Yansong，DAI Lijun，YI Yonghong.Department of Human Anatomy and Neurobiology College of Basic Medicine Central South University，Changsha 410013，China.Tel：020－34152641.

【Abstract】Objective To study the theraputic effects of lithium chloride on step-through behaviors and the activity of Glycogen Synthase Kinase 3β（GSK3β）in Fragile X Syndrome in mice.Methods Thirty-day-old wildtype（WT）or Fmr1 KO littermates received either normal saline or different doses of lithium chloride（30 mg／kg，60 mg／kg，90 mg／kg，120 mg／kg or 200 mg／kg）for five consecutive days.Step-through testing was used to detect the latency period and error count at 4 and 5 days following lithium treatment.Meanwhile，Western blot was used to examine the expression of GSK3β and Phosphorylated GSK3β（P-GSK3β）in mouse hippocampus and cortex.Results Compared with non-treated WT mice， non-treated KO mice had shorter latency period and more error counts in passive avoidance tests， suggesting that KO mice had learning and memory impairments.The expression level of phosphorylated P-GSK3β） was lower in Fmr1 KO than in WT mice.Lithium treatment could recover the learning and memory impairments and increase the expression level of P-GSK3.Conclusions Lithium ameliorates passive avoidance impairment probably through increasing the expression of P-GSK3βin the Fmr1 knockout mice.

【Key words】Fragile X Syndrome Fmr1 gene knockout mice Step-through test Glycogen synthase kinase3β Phosphorylated GSK3β Lithium Chloride