李淑芳 桑小军

包头医学院第一附属医院药剂科，内蒙古包头014010

神经干细胞是神经系统里面有自我增殖能力和多向分化潜能以及自我更新能力的多能干细胞，相关实验证实可分化为神经系统的细胞［1］。本实验从新生大鼠大脑匀浆分离培养神经干细胞，并且在普通血清内进行体外诱导分化，经证实为星形胶质细胞和神经元，为体内诱导神经元和神经胶质细胞的增殖修复神经组织探索新的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

干细胞常规培养基包含DMEM/F12和B27以及表皮细胞生长因子 (EGF)、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)。nestin抗体，NSE，GFAP通用型免疫组化试剂盒，以上材料来源于武汉博士德生物工程有限公司。新生1日龄Wistar大鼠30只，包头医学院动物中心提供。

1.2 细胞培养

无菌处死新生大鼠去大脑，加入胰酶和EDTA各1ml，恒温37℃消化时间8min，使组织细胞分离，并且吸管轻轻吹打充分分离细胞，以便于计数，计数完毕后后稀释至以1X105/ml接种细胞培养瓶内，常规DMEM/F12和B27以及表皮细胞生长因子 (EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)培养。每6天传代1次，根据显微镜下计数绘图形成生长曲线。

1.3 细胞免疫学鉴定

对连续培养的神经干细胞和分化细胞进行细胞免疫学检测。神经干细胞检测指标为nestin检测，取出细胞爬片放到35 mm细胞培养皿里，PBS洗3次。4%冷的多聚甲醛固定20min，PBS洗3次。然后0.2%Triton X－100通透10 min，PBS洗3次。接着与二抗相同宿主的血清封闭30min，PBS洗3次。一抗4摄氏度湿盒内过夜，PBS洗3次。二抗室温2h避光，PBS洗3次。最后蒸馏水洗掉PBS，甘油封片。荧光显微镜下观察，巢蛋白在细胞质表达，呈现红色荧光。……