陈保文，都伟欣，杜蓉，闫李侠，郭磊，杨蕾，王国治

·论著·

反相高效液相色谱法和16S rRNA序列分析法对分枝杆菌分型鉴别的比较研究

陈保文，都伟欣，杜蓉，闫李侠，郭磊，杨蕾，王国治

目的比较反相高效液相色谱法（RP-HPLC）和 16S rRNA序列分析法对分枝杆菌分型鉴别的异同。

分枝杆菌属； 分枝菌酸； 色谱法，高压液相； 细菌分型技术； 序列分析，DNA； 16S rRNA

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2012, 7(4):263-269

我国是全球 22 个结核病高负担国家之一，肺结核患者数位居世界第二。2000 年全国第四次结核病流行病学抽样调查报告显示非结核分枝杆菌（NTM）感染比例明显增加，1984 – 1985 年为 4.2％，1990 年为 4.9％，而 2000 年则增至11.1％[1]。NTM 所引起的结核样病变与结核分枝杆菌引起的结核病临床表现相似，很难鉴别，但药物敏感性和化疗方案根据不同菌种有所不同。因此，分枝杆菌菌种的快速鉴定不仅在流行病学上，而且在临床诊断和治疗上均有十分重要的意义。

结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌统称为结核分枝杆菌复合群（MTB），和 NTM 在微生物分类中均属于放线菌目分枝杆菌科分枝杆菌属。涂片镜检均呈抗酸杆菌阳性，培养特性和生化反应虽然被称为“金标准”，但所需时间长且步骤繁琐。分枝杆菌细胞壁脂质中含有丰富的分枝菌酸（mycolic acid，MA），MA 是一类高分子量的含有 α-支链、β-羟基脂肪酸的化合物，其脂肪酸上碳链的长度、不饱和状态、官能团及含量在各生物种型之间呈现指纹特征的特点。因此，利用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对分枝杆菌的分枝菌酸进行色谱图的构建，可将分枝杆菌鉴定到种的水平。rRNA 基因被称为细菌的“活化石”，是目前细菌系统发育分类与鉴定的最常用靶基因，其中 16S rRNA 基因因其大小适中、信息量大且高度保守，又能利用测序技术较易得到其序列，故被细菌学家和分类学家所接受[2]。本研究针对《伯杰细菌鉴定手册》中载入的 54 种分枝杆菌中的 49 种模式株采用 RP-HPLC 和 16S rRNA 基因序列分析法分别进行了 MA 色谱图的构建和 16S rRNA基因测序，以比较两种方法对分枝杆菌分型鉴别结果的异同。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株 鸟分枝杆菌（M. avium，95001）、胞内分枝杆菌（M. intracellulare，95002）、蟾蜍分枝杆菌（M. xenopi，95003）、溃疡分枝杆菌（M. ulcerans，95004）、土地分枝杆菌（M. terrae，95005）、胃分枝杆菌（M. gastri，95006）、不产色分支杆菌（M. nonchromogenicum，95007）、施氏分枝杆菌（M. shimoidei，95008）、次要分枝杆菌（M. triviale，95009）、产鼻疽分枝杆菌（M. farcinogenes，95012）、堪萨斯分枝杆菌（M. kansasii，95013）、海分枝杆菌（M. marinum，95014）、猿猴分枝杆菌（M. simiae，95015）、亚洲分枝杆菌（M. asiaticum，95016）、瘰疬分枝杆菌（M. scrofulaceum，95017）、戈登分枝杆菌（M. gordonae，95018）、苏加分枝杆菌（M. szulgai，95019）、龟分枝杆菌龟亚种（M. chelonae subsp. Chelonae，95020）、龟分枝杆菌脓肿亚种（M. chelonae subsp. Abscessus，95021）、偶然分枝杆菌（M. fortuitum，95022）、耻垢分枝杆菌（M. smegmatis，95023）、草分枝杆菌（M. phlei，95024）、抗热分枝杆菌（M. thermoresistibile，95025）、爱知分枝杆菌（M. aichiense，95026）、金色分枝杆菌（M. aurum，95027）、楚布分枝杆菌（M. chubuense，95028）、杜氏分枝杆菌（M. duvalii，95029）、微黄分枝杆菌（M. flavescens，95030）、加地斯分枝杆菌（M. gadium，95031）、浅黄分枝杆菌（M. gilvum，95032）、科莫斯分枝杆菌（M. komossense，95033）、新金色分枝杆菌（M. neoaurum，95034）、奥布分枝杆菌（M. obuense，95035）、副偶然分枝杆菌（M. parafortuitum，95036）、罗德岛分枝杆菌（M. rhodesiae，95037）、东海分枝杆菌（M. tokaiense，95038）、猪分枝杆菌（M. porcinum，95039）、灰尘分枝杆菌（M. pulveris，95040）、塞内加尔分枝杆菌（M. senegalense，95041）、诡诈分枝杆菌（M. fallax，95042）、田野分枝杆菌（M. agri，95043）、南非分枝杆菌（M. austroafricanum，95044）、迪氏分枝杆菌（M. diernhoferi， 95045）、千田分枝杆菌（M. chitae，95046）、田鼠分枝杆菌（M. microti，95048）、非洲分枝杆菌（M. africanum，95049）、母牛分枝杆菌（M. vaccae，95051）、结核分枝杆菌（M. tuberculosis，95053）、牛分枝杆菌（M. bovis，95055）共 49 株，均由中国医学细菌保藏管理中心[CMCC（B）]提供。

1.1.2主要试剂 色谱纯甲醇、二氯甲烷和氯仿均为美国 J. T. Baker 公司产品；色谱纯双环己基-18-冠-6 醚及 4-溴苯乙酰基溴为美国 Fluka 公司产品；高分子量内标（HW-ISTD）由美国疾病预防控制中心的 Butler W.R. 赠送。PCR 扩增引物和测序引物相同，均由上海英骏生物工程有限公司合成。DNA 片段纯化试剂盒（DNA fragment purification kit）、DNA marker DL 1000、rTaq 酶和Goldview 等均购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3主要仪器 配有自动进样器、紫外检测器、色谱工作站的 Agilent 1100 型高效液相色谱仪为美国 Agilent 公司产品；色谱柱为 Agilent Zorbax SB-C18 柱，柱温为 35 ℃；流动相 A 为 95％ CH3OH 和 5％ CH2Cl2，B 为 5％ CH3OH和 95％ CH2Cl2；流速为 1.5 ml/min；UV 检测波长为 260 nm；进样量为 20 µl；2400 型 PCR 扩增仪为美国Applied Biosystems 公司产品。

1.2 方法

1.2.1菌株培养 将各菌株接种于改良罗氏培养基斜面上，根据其生长特征放置于适宜温度进行培养，快生长菌培养 1 周，慢生长菌培养 3 ～ 4 周。

1.2.2分枝菌酸的 HPLC 分析 具体操作参照文献[3]。刮取生长良好且无污染的分枝杆菌培养物，经皂化、提取、衍生、萃取等步骤获得分枝菌酸样品，然后浓缩至干燥。分析前用 CH2Cl2溶解样品，并加入适量高分子量内标，用高效液相色谱仪进行 MA 样品的 HPLC 色谱图分析。采用M. intracellulare 作为质控菌种样品；每 10 个样品进样后，进行一次 M. intracellulare 的分析，作为结果的控制指标，以确保色谱、系统方法的有效性和准确性。

1.2.316S rRNA 基因序列分析 具体操作参照文献[4]。取生长良好且无污染的菌种培养物，经细菌裂解、DNA 制备、PCR 扩增以及 DNA 纯化后，进行上、下游测序，并将双向结果拼接后得到最准确序列。PCR 上游引物（位于分枝杆菌 16Sr RNA 基因的 62 ～ 85位核苷酸）为 5′ CACATGCA AGTCGAACGGAAAGG 3′，下游引物（位于分枝杆菌 16S rRNA 基因 626 ～ 647 位核苷酸）为 5′GCCCGTATCGCCCGCACGCT 3′，上下游引物扩增16S rRNA 基因 5′ 端长度约 585 bp 的片段。

对所测定序列用 Clustalx 1.83 软件进行同源性多序列比对，并用邻位相连法（neighbour joining，N-J 法）绘制 16S rRNA 基因序列聚类分析树状谱，使用 DNAStar 公司的 MegAlign 软件计算相似性百分比。

2 结果

2.1 MA 的 RP-HPLC 分析

2.1.1MA 色谱图的构建 采用 RP-HPLC 法建立了《伯杰细菌鉴定手册》中载入的 49 种分枝杆菌模式株的 MA 色谱图，结果显示不同分枝杆菌的 MA 色谱图分别具有单簇峰（典型图谱见图 1）、双簇峰（典型图谱见图 2）和三簇（含多簇）峰（典型图谱见图 3）三类特征（表 1）。

图1 典型单簇峰谱图Figure 1 Pattern single peak-cluster

2.1.2MA 的色谱图分析 49 种分枝杆菌模式株中有 42 种可明确进行鉴别，仅单簇峰中的牛分枝杆菌、结核分枝杆菌和胃分枝杆菌，双簇峰中的爱知分枝杆菌和罗德岛分枝杆菌，三簇峰中的南非分枝杆菌和母牛分枝杆菌这 7 种因各组内相对保留时间（RRT）和相对峰高比均相似，采用RP-HPLC 法较难以进行鉴别。

图2 典型双簇峰谱图Figure 2 Pattern double peak-clusters

图3 典型三簇峰谱图Figure 3 Pattern triple peak-clusters

表1 49 种分枝杆菌模式株的分枝菌酸 HPLC 峰形分类表Table 1 HPLC chromatographic classification of mycolic acids of 49 kinds of mode strains ofMycobacterium

2.2 16S rRNA 序列分析

2.2.116S rRNA 基因的 PCR 扩增 成功完成49 种分枝杆菌模式株 16S rRNA 基因的 PCR 扩增，均得到一条约 585 bp 的 16S rRNA 5′ 端DNA 片段，与目的条带大小相符。

2.2.216S rRNA 基因序列分析 通过同源性序列比对，绘制 16S rRNA 基因序列聚类分析树状谱，并计算菌株间相似百分比[4]。结果显示：49 种分枝杆菌模式株中有 37 种可明确进行鉴别，而产鼻疽分枝杆菌和塞内加尔分枝杆菌、溃疡分枝杆菌和海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌、龟亚分枝杆菌和龟脓分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群这 12 种因各组内之间 16S rRNA 基因序列相似性百分比为 100％，难以进行鉴别。

2.3 分枝菌酸 RP-HPLC 法和 16S rRNA 序列分析法对分枝杆菌分型鉴别的结果比较

2.3.116S rRNA 基因序列分析法无法鉴别的菌种

⑴16S rRNA 基因序列无法区分产鼻疽分枝杆菌和塞内加尔分枝杆菌，采用分枝菌酸 RP-HPLC法则可对这两种分枝杆菌加以鉴别。图 4 可见，两者均呈现出 9 个锋，但其相对峰高比呈现差异，产鼻疽分枝杆菌的 6#峰高于 8#峰，而塞内加尔分枝杆菌的 6#峰高约为 8#峰高的 1/2。

⑵16S rRNA 基因序列无法区分海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌，而采用分枝菌酸RP-HPLC法可对这两种分枝杆菌加以明确鉴别。图 5 可见，两者均呈现出 8 个峰，但其 RRT 和相对峰高比均呈现明显差异，海分枝杆菌色谱峰的 RRT（13.441 ～ 17.417 min）比溃疡分枝杆菌色谱峰的 RRT（14.880 ～ 18.393 min）早出峰约 1.4 min；且海分枝杆菌的2#峰值最高，约为 3#峰的 1.5 倍，而溃疡分枝杆菌的 2#峰却要低于 3#峰。

⑶16S rRNA 基因序列无法区分堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌，与文献[5-7]报道一致。而采用RP-HPLC 法可对这两种分枝杆菌加以明确鉴别。图 6 可见，堪萨斯分枝杆菌色谱峰的 RRT（15.018 ～ 18.630 min）比胃分枝杆菌色谱峰的 RRT（16.563 ～ 19.516 min）早出峰约 1.5 min。

⑷16S rRNA 基因序列无法区分龟分枝杆菌龟亚种和龟分枝杆菌脓肿亚种。采用 RP-HPLC 法可对这两种分枝杆菌加以鉴别。图 7 可见，两者两簇色谱峰的 RRT 几近相同，但进一步采用相对峰高比可进行分型鉴别[8]，对于第一簇色谱峰，龟分枝杆菌龟亚种的 2#峰与 3#峰相当，而龟分枝杆菌脓肿亚种的 2#峰高约为 3#峰高的 1/5。

图4 产鼻疽分枝杆菌和塞内加尔分枝杆菌色谱图比较Figure 4 HPLC chromatograms ofM. farcinogenesandM. senegalens

图5 海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌色谱图比较Figure 5 HPLC chromatograms ofM. marinumandM. ulcerans

图6 堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌色谱图比较Figure 6 HPLC chromatograms ofM. kansasiiandM. gastri

⑸16S rRNA 基因序列无法区分结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。Strain 等[9]研究认为，结核分枝杆菌和牛分枝杆菌有着相同的 MA 组成，采用 RP-HPLC 也无法进行鉴别，本实验结果与文献报道一致。图 8 可见，结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的色谱图极为相似，各峰 RRT 和峰高均较一致，故难以鉴别；田鼠分枝杆菌色谱峰的 RRT 与结核、牛分枝杆菌虽类似，但田鼠分枝杆菌的 3#峰值最高，而结核和牛分枝杆菌的 5#峰值最高，且峰值远高于 3#峰，故容易鉴别；非洲分枝杆菌的色谱图与其他 3 种分枝杆菌的谱图则明显不同，能进行明确鉴别。

2.3.2分枝菌酸 RP-HPLC 法无法鉴别的菌种

⑴RP-HPLC 无法鉴别具有单簇峰的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。胃分枝杆菌色谱图的相对峰高比虽与前两者略有差异，但仍较难鉴别。采用 16S rRNA 基因序列分析法可见，结核和牛分枝杆菌的16S rRNA 基因序列的相似性为 100％，无法进行鉴别；而胃分枝杆菌与前两者亲缘关系较远，与结核分枝杆菌的相似性为 97.0％，很容易进行鉴别。

⑵RP-HPLC 无法鉴别的具有双簇峰的爱知分枝杆菌和罗德岛分枝杆菌，采用 16S rRNA 基因序列分析法可见，爱知分枝杆菌和罗德岛分枝杆菌尽管亲缘关系很近，其 16S rRNA 基因序列的相似性为 99.7％，但可变区有 3 个位点碱基发生突变，可以进行鉴别。

⑶RP-HPLC 无法鉴别的具有三簇峰的南非分枝杆菌和母牛分枝杆菌，采用 16S rRNA 基因序列分析法可见，两者尽管亲缘关系很近，16S rRNA 基因序列的相似性为 99.8％，但可变区有两个位点碱基发生突变，可以进行鉴别。

图7 龟分枝杆菌龟亚种和龟分枝杆菌脓肿亚种色谱图比较Figure 7 HPLC chromatograms ofM. chelonaesubsp. ChelonaeandM. chelonae subsp. Abscessus

3 讨论

本研究分别采用分枝菌酸 RP-HPLC 法和16S rRNA 序列分析法对《伯杰细菌鉴定手册》中载入的 49 种分枝杆菌模式株进行分型鉴别。结果表明，分枝菌酸 RP-HPLC 分析法可将 42 种分枝杆菌进行明确鉴别，而牛分枝杆菌、结核分枝杆菌和胃分枝杆菌，爱知分枝杆菌和罗德岛分枝杆菌、南非分枝杆菌和母牛分枝杆菌这 7 种分枝杆菌因各组内相对保留时间（RRT）和相对峰高比均相似，难以进行鉴别；16S rRNA 基因序分析法可将37 种分枝杆菌进行明确鉴别，而产鼻疽分枝杆菌和塞内加尔分枝杆菌，溃疡分枝杆菌和海分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌，龟亚分枝杆菌和龟脓分枝杆菌，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌这 12 种分枝杆菌因各组内之间 16S rRNA 基因序列相似性百分比为100％，难以进行鉴别。两种方法在分枝杆菌分型上虽存在一定的局限性，但两者相互补充，可将除结核分枝杆菌和牛分枝杆菌以外的 47 种分枝杆菌准确地鉴定到种的水平。

传统分型法主要包括生长特征和生化特征的检测，其中生长特征包括生长速度、色素产生、生长温度以及培养基鉴别试验等，生化特征包括吐温-80 水解试验、尿素酶试验、芳香硫酸脂酶试验、铁离子吸收试验、亚碲酸盐还原试验等[10]。分枝杆菌培养周期长，短则 1 周，长则 4 周以上。检测结果依赖于生长状态，容易受温度、培养基、生化反应试剂、技术人员操作水平等诸多因素的影响，结果分析通常比较困难。而 16S rRNA 基因序列分析法和分枝菌酸 RP-HPLC 法虽需借助较昂贵的仪器来完成，但检测时间短，方法稳定可靠，结果更准确和有效。

随着我国国力的迅速增强，大中型城市已日益具备开展 16S rRNA 基因序列分析和分枝菌酸RP-HPLC 检测技术的条件。目前，在建立模式菌株信息库的基础上，还需收集大量的临床分离分枝杆菌进行进一步的完善，以期开发一种能进行分枝杆菌分型的软件系统，填补我国在该领域的空白。

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Identification of Mycobacterium species by reversed phase high performance liquid chromatography and 16S rRNA sequence analysis

CHEN Bao-wen, DU Wei-xin, DU Rong, YAN Li-xia, GUO Lei, YANG Lei, WANG Guo-zhi

ObjectiveTo compare the reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and 16S rRNA sequence analysis for the identification of Mycobacterium species.Methods49 Mycobacterium species which recorded in ‘Bergey’s manual of systematic bacteriology’ were inoculated in Lowenstein cultured medium. Mycolic acids from each culture of Mycobacterium species were extracted, saponified, acided, derivatized and analyzed by the RP-HPLC and a mycobacteria mycolic acids fingerprints library of HPLC patterns was constructed. The DNA of each culture of Mycobacterium species was also amplified by PCR and purified for the identification by 16S rRNA sequencing.ResultsAmong 49 Mycobacterium mode strains, 7 kinds of strains, which included single-cluster peak of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis and Mycobacterium gastri, double-cluster peaks of Mycobacterium aichiense and Mycobacterium rhodesiae, and triple-cluster peaks of Mycobacterium austroafricanum and cMycobacterium vaccae, were difficult to be identified because of the similarity of relative retention time and relative peak height ratio using RP-HPLC. Using analysis of 16S rRNA sequence analysis, 12 kinds of strains, which included Mycobacterium farcinogenes and Mycobacterium senegalense,Mycobacterium ulcerans and Mycobacterium marinum, Mycobacterium kansasii and Mycobacterium gastri, Mycobacterium chelonae subsp. Chelonae and Mycobacterium chelonae subsp. Abscessus, and Mycobacterium tuberculosis complex (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti and M. africanum), were difficult to be identified because of the same gene sequences. Using the two complementary methods, 47 of the 49 Mycobacterium species could be clearly identified except M. tuberculosis and M. bovis.ConclusionThe combination of RP-HPLC and 16S rRNA sequence analysis provides an accurate and efficient technique for Mycobacterium identification. With these two complementary methods, most of the Mycobacterium species can be well distinguished and identified.

Mycobacterium; Mycolic acids; Chromatography, high pressure liquid; Bacterial typing techniques; Sequence analysis, DNA; 16S rRNA

WANG Guo-zhi, Email: tbtestlab@163.net

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.04.0?03

重大传染病诊断产品质量评价综合技术平台（2009ZX10004-805）

100050 北京，中国食品药品检定研究院（陈保文、都伟欣、闫李侠、杨蕾、王国治）；100850 北京，军事医学科学院毒物药物研究所（杜蓉、郭磊）

王国治，Email：tbtestlab@163.net

2012-03-05

方法将《伯杰细菌鉴定手册》中载入的 49 种分枝杆菌模式株接种于改良罗氏培养基上，置于最适温度下孵育。挑取生长良好且无污染的培养物，一部分经皂化和酸化提取分枝菌酸并衍生后，采用反相高效液相色谱法进行分枝菌酸指纹图谱构建；另一部分经裂解和 PCR 扩增，获得 DNA，纯化后，采用核酸分析仪进行 16S rRNA 序列测定。

结果49 种分枝杆菌模式株中，采用 RP-HPLC 分析时，单簇峰的结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和胃分枝杆菌，双簇峰的爱知分枝杆菌和罗德岛分枝杆菌，三簇峰的南非分枝杆菌和母牛分枝杆菌共 7 种因各组内相对保留时间和相对峰高比值相近而难以进行鉴别；采用 16S rRNA 序列分析法分析时，产鼻疽分枝杆菌和塞内加尔分枝杆菌、溃疡分枝杆菌和海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌、龟亚分枝杆菌和龟脓分枝杆菌以及结核分枝杆菌复合群（结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌和非洲分枝杆菌）共 12 种因各组内基因序列相似性百分比为 100％ 而难以进行鉴别。通过两种分型鉴别方法的比较，可见除结核分枝杆菌和牛分枝杆菌外，两种分型方法相互补充，可将 49 种分枝杆菌模式株中的 47 种进行明确鉴别。

结论分枝菌酸 RP-HPLC 和 16S rRNA 序列分析法均为分枝杆菌的分型鉴定提供了准确和有效的技术方法。两种方法相互借鉴能准确地将大多数分枝杆菌鉴定到种。

Author Affiliations:National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China (CHEN Bao-wen, DU Wei-xin, YAN Li-xia, YANG Lei, WANG Guo-zhi); Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology, Beijing 100850, China (DU Rong, GUO Lei)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(4):263-269