萧 云综述，陈煜森审校

（广东医学院附属医院神经内科，广东 湛江 524000）

血小板微粒体(Platelet microparticles，PMP)主要为血小板在受到不同刺激作用下细胞膜向外伸展变形，细胞膜部分以出芽方式形成小囊泡或伪足脱落进入微循环而形成的细小微粒，是血小板粘附或活化的产物。PMP的体积小于正常的血小板，直径0.1～1.0 μm，但具有完整的膜结构，其膜的成分与血小板相同，表达一些血小板的膜糖蛋白（GP）、血小板活化因子（PAF）、β-淀粉样前体蛋白、Ca2＋依赖性蛋白酶（Calpain）和有促凝作用的磷脂等。PMP是血液循环中含量最多的微粒体，占所有微粒体的70%～90%，在多种生理和病理过程中起着重要作用。正常人血液中含有少量PMP。本文就血小板微粒体的生物特性、检测及其在缺血性脑卒中的研究进展做一综述。

1 血小板微粒体的生物学特点

1.1 血小板微粒体的来源及形成机制 体内PMP主要来源于活化的血小板；而体外研究PMP的产生，必须先通过各种途径激活血小板。目前研究发现高切应力和多种激活剂，如凝血酶、胶原、肾上腺素、ADP、钙离子载体A23187及终端补体复合物C5b-9、抗血小板抗体等有关，作用于血小板均可引起PMP的释放，但不同的激活剂诱导所产生的PMP大小相差甚远。PMP的形成和释放机制目前尚不十分清楚，但普遍认为细胞膜极性丢失及细胞膜骨架重排起到重要的作用。

细胞膜脂质双层中的脂质成分呈不对称分布，带负电荷的氨基磷脂（磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺）几乎全部分布在膜靠近胞质的内层，而磷脂酰胆碱和鞘脂主要分布在膜的外层。细胞通过酶消耗能量来维持膜脂质不对称性，在此过程中氨基磷脂转移酶、翻转酶（Flippase）和磷脂爬行酶（Scramblase）起到重要作用。当细胞受到促凝、促炎症等刺激时通常引起胞外Ca2+内流或胞内Ca2+贮存库的释放，导致胞浆Ca2+浓度升高，进而氨基磷脂转移酶和Scramblase激活，同时Flippase受到抑制，最终致使膜磷脂重新分布，磷脂酰丝氨酸（PS）由膜内层迁移至外层，引起PS暴露、出芽。钙离子流增加还可以活化Calpain，从而引起细胞骨架蛋白分子的变化。Calpain活化使细丝蛋白与肌球蛋白裂解，打乱维持支撑细胞膜的正常细胞骨架结构，可引起细胞收缩和细胞骨架重建，细胞外形改变、出芽，这些隆起的泡状物挤压胞膜并脱落，因此脱落的细胞微粒整合了一部分的源细胞膜表面蛋白和其他成分。

研究发现早期凋亡的血小板通过细胞膜骨架的重塑和出芽方式也可以产生血小板微粒体。早期凋亡的细胞产生微粒体依赖于pho相关的激酶ROCK1，这个酶是通过CASPASE蛋白酶裂解介导激活的，通过裂解激活的ROCK1可以促进细胞膜中肌球蛋白轻链的磷酸化以及肌动蛋白肌丝耦合断裂，进而引起细胞膜骨架的重排，最终导致微粒体的产生。

2009年，Flaumenhaft等[1]发现在培养中鼠和人的巨核细胞中可产生CD41及CD61阳性的微粒，但不同于血小板分泌的PMP，不表达CD62或LAMP-1，而且细胞骨架含量下降，为健康人群中PMP绝对组成部分。2010年，Rank等[2]发现骨髓经过放射后，循环血中CD61阳性微粒大部分消失，而CD62阳性微粒继续存在，进一步支持了巨核细胞来源的PMP。

1.2 血小板微粒体的生物学功能。

1.2.1 促凝血功能[3]PMP具有促凝血活性，来自血小板激活过程中所释放的其表面富含的PS、Ⅷ因子和Va因子。PS促进了细胞和细胞之间的相互作用及在Ca2+存在的条件下促凝血；Ⅷ因子为Tenase酶复合物形成的协同因子；Va因子结合Xa因子后可形成凝血酶原酶的复合物。虽然Ⅷ因子连接血小板是不稳定的，但Ⅷ因子和Va因子可稳定地结合于PMP的表面，因此PMP可以不依赖血小板的激活而促进凝血，且这种促凝血活性比血小板激活所致的凝血能够持续更长的时间。PMP经血小板活化形成之后，又可通过其含有的PAF、Calpain、PS等直接活化血小板，并且通过GPⅠb与内皮下基质结合作为底物促进血小板进一步粘附于内皮细胞。此外，PMP还可通过与内皮细胞、单核细胞的作用而促进血小板的活化。

1.2.2 抗凝血功能 PMP可通过抑制蛋白C激活Va因子通路而抑制凝血功能，蛋白C的抑制剂可结合于血小板和PMP表面的磷脂酰乙醇胺，从而有效抑制磷脂所激活的蛋白C的通路。目前认为PMP具有的抗凝活性可能与磷脂在内外小叶之间的不完全翻转有关，但以促凝血还是抗凝血为主的具体机制仍需要进一步研究探讨[4-5]。

1.2.3 传递生物信息的作用 PMP通过与靶细胞发生粘附，将其胞膜上生物活性物质或胞浆成分传递给靶细胞，从而影响靶细胞的生物学功能。例如：PMP可激活平滑肌细胞MAPK p42/44的通路[6]；PMP通过转移CD41抗原而增强骨髓来源的造血干细胞对胶原蛋白的粘附能力[6]；PMP表达CXCR4，可将其传递给CXCR4(-)细胞，结果导致这些细胞获得对HIV的易感性[7]。

2 血小板微粒体的检测方法

目前大约75%的实验室在使用流式细胞仪（FCM）测定PMP，是最常用的检测方法。但其他细胞如红细胞、单核细胞、白细胞等也能产生直径小于1.0 μm的微颗粒，细菌尘粒等污染都可能干扰PMP的定量测定。FCM测定法可利用PMP表面的抗原荧光抗体对其膜上的特异蛋白进行标记，进一步对其加以区别，然后根据其前向角散射光（FS）及荧光强度（FL）进行定量检测。常用的方法有：全血法、富含血小板血浆（PRP）法、乏血小板血浆（PPP）法、内参定位法及改良流式细胞术等。PRP法样品处理过程简单，只需制备PRP，避免了PPP法中多次离心所造成的PMP丢失，成为大多数实验室的首选方法。

流式细胞仪检测微粒的大小受到波长的限制，小于0.5 μm的微粒很难检测到，尽管新型的流式细胞仪和使用微球定位能检测到0.3 μm的微粒，甚至更小的微粒，但是通过对比其他检测技术（如原子力量显微镜），发现流式细胞仪低估了PMP的数量[8]。此外，由于PMP亚型的性质不同，单用某种抗体标记物也可以低估PMP的数量。

在检测过程中由于使用流式细胞仪机器型号、样本处理、参数设置及分析方法不同，导致FCM测定的血小板微粒体数量范围在100～40 000/μl之间广泛波动，因此国际血栓与止血协会的科学标准委员会发布了FCM标准化PMP检测指南[9]，而且被证实能在不同实验室可靠检测PMP[10]。在检测之前，样本的处理也同样要标准化，包括样本的离心步骤，冰冻、抗凝、延迟时间、运输、保存、融解等环节亦需进一步探讨[11-12]，但这方面的报道比较少，此外，分析方法亦需要一个统一的标准。

一些新的技术如以阻抗为基础的流式细胞术、电化学阻抗分析、原子力量显微镜、动态光散射检测在PMP的检测取得很大的进展，特别是可以不管微粒的大小检测所有的微粒，但上述仪器昂贵稀少以致难以有效广发应用，并且缺乏有效的抗体分子标记物。总而言之，尽管FCM存在缺陷，但因其操作简便，速度快和结果准确，目前仍是最好检测PMP的方法，特别是临床应用。

3 血小板微粒体在缺血性脑卒中的临床意义

3.1 血小板微粒体与不同亚型缺血性脑卒中的相关性 1996年，Bulboacă[13]用电子显微镜观察到缺血性脑卒中患者血小板活化释放微囊泡（Microvesicles），而健康个体中观察不到这种现象。研究发现一名特发性血少板减少性紫癜（ITP）伴有进展性认知功能障碍的患者，血样中PMP数量明显增高。回顾分析这些患者发现，没有出血症状的患者比有出血症状的患者PMP增高，伴有认知功能障碍的患者PMP增高更明显，这些患有认知功能障碍的患者经MRI证实有脑缺血疾病，因此推测PMP在ITP患者中替代了血小板功能而限制出血，在高水平时诱发脑微血管的血栓形成[14]。随后Ahn等[15]通过增加观察样本及采用更先进的影像学检测进一步证实了上述观点。于是在非ITP的缺血性脑血管疾病患者中是否能观察到PMP增高这个问题引起了广泛兴趣。Lee等[16]及其研究团队观察了短暂性脑缺血（TIA）、小血管脑卒中、大血管脑卒中、多发性硬化及阿尔茨海默病患者，发现除了阿尔茨海默病外，都能够观察到PMP数量增高，而且小血管脑卒中比大血管脑卒中增多得更明显，因此，推测长期及高水平的PMP或者某些亚型PMP可能会诱导脑缺血。1998年，在人工心脏瓣膜患者的研究中，Geiser等[17]首次报告了脑血管疾病与外周血PMP之间的病理生理联系。

3.2 在缺血性脑卒中急性期的血小板微粒体变化 在脑梗死的急性期可以发现外周血PMP水平升高。2003年，Cherian等发现[18]，在脑梗塞急性期，外周血PMP升高与内皮功能异常的标记物P-选择素和E-选择素等相关，而且E-选择素血液浓度的升高与全部类型脑梗死强相关，特别是由大动脉的动脉粥样硬化所致的脑梗死。2009年，Kuriyama等[19]拿发现在脑梗塞急性期血液中的PMP（ELISA法评估）水平升高，而其升高与颈动脉内膜中层厚度（IMT）和颈动脉颅内段狭窄相关。与心源性中风的患者相比，大脑前、后、中动脉脑梗死及腔隙性脑梗死患者的PMP水平显著性升高，这可能有助于心源性和血栓性中风之间的鉴别诊断。小血管闭塞或大血管闭塞所致急性期脑梗塞的PMP水平均比对照组高，其升高与伴随的IMT、颅内动脉狭窄显著性相关，这些证据是非常支持血液PMP水平可作为动脉粥样硬化斑块的生物评价的重要指标[20]。Csongrádi等[21]在肥胖患者中发现PMP水平与IMT以及动脉粥样硬化其他危险因素存在正相关，进一步支持上述观点。

3.3 在缺血性脑卒慢性期中的血小板微粒体变化 在脑梗死慢性期，外周血PMP水平仍然升高，并且未受一些特殊的抗血小板治疗所影响（阿司匹林联合西洛他唑）[22]。而相反，TIA患者经抗血小板治疗（阿司匹林和氯吡格雷的组合）可使外周血PMP下降[23]。由于PMP的水平在脑梗死慢性期与脑梗死急性期比较仍然是不变的，因此，脑梗死患者PMP可能是脑动脉粥样硬化斑块的剪应力增加评估的特异生物指标。Maria等[24]在评估脑梗死慢性期血小板活性及反应性时发现，PMP水平增高与P-选择素呈负相关，血小板活性逐渐增高，PMP分离现象占主导优势，容易受到抗血小板药物的影响。由于PMP促凝作用及血栓形成的特性，不利于脑梗死预后。因此，脑梗死患者PMP的评估不仅显示血小板活化，而且可显示内皮功能障碍，可能是一个重要的预后参数。

3.4 治疗缺血性脑卒的潜在策略 尽管目前对PMP水平增高诱发了脑梗死还是脑梗死导致PMP水平增高仍存在争议，但2008年Ahn就提出了将降低PMP作为治疗脑梗死的手段。抑制PMP的形成或者阻断各细胞来源微粒体的相互作用是两种基础的方法。目前已经清楚有几种微粒体抑制剂，例如Calpain抑制剂，然而这些药物是否适合人体内使用仍在探索阶段。PMP抑制剂还可以明显抑制来源于内皮细胞的微颗粒形成，获得收益远远超过其已知的药理学作用。

综上所述，PMP主要来源于活化的血小板，参与正常生理及病理情况下的止血过程，可反映血栓或血栓前状态。FCM检测PMP的方法具有操作简单及客观精密等优点，为其在临床的广泛应用提供了有效的检测手段。PMP的定量检测对脑梗死的诊断、治疗和预后评估有重要意义。PMP在脑缺血性疾病发病机制中起重要作用，但其具体作用机制仍不清楚；抑制PMP形成成为治疗脑梗死的新策略，但缺乏循证医学证据支持；已知几种抑制PMP生成的药物，但在人体实验中尚缺乏稳定性。深入研究PMP的生理病理效应将为进一步揭示脑梗死的发病机制、特异性治疗方法及预防提供重要的理论依据。

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