金洁 樊明文 李宇红

（1.杭州口腔医院 牙体牙髓病科，杭州310006；2.口腔生物医学工程教育部重点实验室，武汉大学，武汉430079）

变异链球菌是龋病的主要致病菌，其表面蛋白（Streptococcus mutans surface protein，PAc）参与介导细菌对牙面的黏附[1]。研究[2]表明：携带PAc主要免疫活性区A-P片段的DNA防龋疫苗pCIA-P可有效诱导实验动物的特异性免疫应答。目前的研究[3-4]认为：以DNA疫苗pCIA-P进行初次免疫，再用蛋白质疫苗PAc加强的策略可在较大程度上提高防龋疫苗的免疫效力。在“DNA初次免疫—蛋白质加强”免疫策略的研究中，大量高纯度的PAc的获取是整个研究的基础。由于变异链球菌表面蛋白的天然产量低，提取步骤烦琐，难以满足需要[5]，所以用基因工程的方法大量生产无疑是最佳选择。笔者对已成功表达重组PAc（recombinant PAc，rPAc）的工程菌pET20b（+）-AP/BL21（DE3）plysS的表达条件进行优化，并用纯化后的rPAc蛋白免疫BALB/c小鼠，制备抗rPAc多克隆抗体，为深入研究“DNA初次免疫—蛋白质加强”免疫策略奠定基础。

1 材料和方法

1.1 rPAc表达条件的优化

在pH值分别为6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4的Luria-Bertani（LB）培养基（含100 μg·mL-1羧苄青霉素和34 μg·mL-1氯霉素）上接种pET20b（+）-AP/BL21（DE3）plysS工程菌[4]，37 ℃条件下培养，检测光密度（optical density，OD）值达0.6（检测波长600 nm）时，加入终浓度为1.0 mmol·L-1的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thigalactopyranoside，IPTG），继续培养4 h，同时设定工程菌的未诱导表达对照组。培养结束后，4 ℃离心收集菌体，冰浴下超声波破碎，离心后取上清液，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析培养基pH值对rPAc可溶性表达的影响，确定培养基的最佳pH值。固定其他条件，按照与上述研究类似的方法，分别设置IPTG浓度梯度（0.1、0.4、0.8、1.0、2.0 mmol·L-1）、时间梯度（1、2、3、4、5 h）、温度梯度（18、24、28、30、37 ℃）、菌体密度梯度（OD600nm分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0）。SDS-PAGE检测rPAc可溶性表达的结果，凝胶成像分析系统（UVP公司，美国）扫描电泳图片，进行半定量分析，确定最优表达条件。

1.2 rPAc的纯化和鉴定

pET20b（+）-AP/BL21（DE3）plysS工程菌根据上述优化条件进行大量诱导表达，结束后集菌，超声波破碎，离心取上清液，经0.45 μm滤器过滤，上样于Ni2+-NTA层析柱纯化（按荷兰Qiagen公司提供的Ni2+-NTA使用说明书进行），SDS-PAGE分析纯化结果。UVP凝胶成像分析系统分析蛋白纯度。rPAc纯化产物的Western blot鉴定参照《分子克隆实验指南》[6]进行，一抗为抗His-tag单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗鼠IgG。将鉴定正确的rPAc纯化产物转入超滤管中进行浓缩及除盐，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）为标准蛋白，用Bradford法定量后冷冻干燥，分装保存。

1.3 抗rPAc多克隆抗体的制备与鉴定

用约50 μg rPAc蛋白免疫BALB/c小鼠，免疫周期为0、14、28、42 d。第1次用弗氏完全佐剂，其余3次用弗氏不完全佐剂。第4次免疫1周后摘取眼球取血，离心分离血清，分装后-80 ℃冻存备用。将纯化的rPAc交联至Sepharose 4B（Pharmacia Biotech公司，美国），其操作步骤参见产品说明。然后将多抗血清用PBS稀释后与交联rPAc介质进行孵育，再用PBS洗脱未结合的蛋白，用甘氨酸-盐酸缓冲液（pH为2.7）洗脱结合的抗体，并用Tris-HCl缓冲液（pH为9.0）将洗脱液中和至pH为7.3左右。酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法测定抗体效价。将纯化后的rPAc行SDS-PAGE后转移至硝酸纤维素膜上，分别用纯化rPAc的多抗血清或抗His-tag单克隆抗体作为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行Western blot分析，方法同1.2。以免疫前的小鼠血清为阴性对照。

2 结果

2.1 rPAc表达条件的优化

利用SDS-PAGE分析不同诱导表达条件下细菌裂解上清液中可溶性rPAc蛋白含量的变化，结果显示：随着IPTG浓度的增加，rPAc可溶性表达量逐渐加大，当IPTG浓度达1.0 mmol·L-1时达到峰值，此后不再明显升高（图1）。随着诱导温度、诱导时间、菌体密度及培养基pH值的增加，可溶性rPAc表达量呈现先升后降的趋势，分别在诱导温度30 ℃、诱导时间4 h、菌体密度OD600nm=0.6、pH=7.2时，rPAc的可溶性表达量达到最大（图2～5）。

图1 rPAc在不同IPTG浓度下的可溶性表达相对含量分析Fig 1 The soluble expression of rPAc under different concentrations of IPTG

图2 rPAc在不同诱导温度下的可溶性表达相对含量分析Fig 2 The soluble expression of rPAc under different inducing temperature

图3 rPAc在不同诱导时间下的可溶性表达相对含量分析Fig 3 The soluble expression of rPAc under different inducing time

图4 rPAc在不同菌体密度下的可溶性表达相对含量分析Fig 4 The soluble expression of rPAc under different growth density

图5 rPAc在不同培养基pH值下的可溶性表达相对含量分析Fig 5 The soluble expression of rPAc under different medium pH

2.2 rPAc的纯化和鉴定

SDS-PAGE分析显示：纯化后的rPAc在相对分子质量为8.5×104处呈单一条带（图6），和预期大小相符。经UVP凝胶成像分析系统扫描分析，其纯度约为95%。采用Bradford法测定纯化蛋白的质量浓度为0.1 mg·mL-1。Western blot结果显示：纯化后的rPAc在相对分子质量为8.5×104处出现阳性反应条带，条带清晰，无其他杂带出现，特异性良好（图7）。对照组无反应条带出现。

2.3 抗rPAc多克隆抗体的制备与鉴定

免疫小鼠的多抗血清经ELISA分析，抗体效价为1∶6 000。Western blot分析结果见图8。抗rPAc多克隆抗体和抗His-tag单克隆抗体在相对分子质量8.5×104大小处均出现特异性的单一阳性条带，无其他可见杂带出现；阴性对照无任何特异性反应条带：说明免疫小鼠的血清经纯化后制备的多克隆抗体可以与rPAc纯蛋白结合并且特异性较好。

图6 rPAc纯化的SDS-PAGE分析Fig 6 The purified rPAc identification by SDS-PAGE

图7 rPAc纯化的Western blot分析Fig 7 The purified rPAc identification by Western blot

图8 抗rPAc多克隆抗体的Western blot分析结果Fig 8 Western blot results of the anti-rPAc polyclonal antibody

3 讨论

为了获取大量高纯度PAc，最大限度地提高rPAc可溶性表达量已经成为关注的重点。可溶性表达的优点为纯化步骤简单，蛋白获得率较高，对蛋白活性影响小。对本研究来讲，能否仅通过优化各种已知的影响原核表达系统的相关因素来有效解决这一难题是首先应该采取的必要措施。为此，本研究针对影响rPAc可溶性表达的各种因素进行了较为系统的探索[7]。

温度是影响目的蛋白在大肠杆菌中获得高水平可溶性表达的重要因素。适合大肠杆菌生长的温度为37～39 ℃，在此温度下表达外源蛋白极易生成包涵体。较低的生长温度能降低蛋白质合成的速率，使新合成的蛋白质有更充分的时间折叠，减少蛋白折叠中间体之间错误的相互作用，使得正确折叠的蛋白增加，有效地增加可溶性蛋白的表达量[8]；但培养温度也有一个下限，一般为8～10 ℃，在此温度以下，大肠杆菌将停止生长，蛋白也基本停止表达[9]。本实验也证实了这一点：在18～37 ℃温度梯度下，诱导温度为30 ℃时，rPAc可溶性表达量达到最大。IPTG是一种有效的乳糖操纵子诱导剂，可竞争性地与阻遏蛋白结合，开放目标蛋白基因，使其得以转录[10]。本实验采用不同浓度的IPTG进行诱导，结果显示：随着IPTG浓度的升高，rPAc可溶性表达量逐渐增加，但当IPTG浓度在1.0 mmol·L-1以上时，rPAc可溶性表达量不再发生明显改变。这是因为当加入的IPTG量足以封闭所有阻遏蛋白位点时，其浓度即为理论上的最佳浓度。IPTG浓度过高可能会影响到细菌的生长，过低会因为浓度达不到与阻遏蛋白结合的饱和浓度而影响目标蛋白的表达。故以1.0 mmol·L-1为最佳IPTG浓度，该浓度不仅可以提高可溶性rPAc的表达量，而且可以降低成本。

菌体生长过度或过速都会加重工程菌合成系统的负担，导致形成包涵体。本实验的目的是蛋白的可溶性表达，故在实验中考察诱导前细菌生长时间和诱导后细菌生长时间对融合蛋白表达的影响。诱导后细菌的生长时间随不同的表达载体或启动子而不同。对T7、Ptac和Plac等启动子，一般仅需2～3 h。本实验采用的表达载体是含有T7启动子的pET表达载体。诱导时间过短会影响rPAc的积累量；诱导时间过长，可溶性rPAc积累量超过一定限度，细菌为了保护自身，减少外源蛋白对其自身的毒性，从而启动包涵体的形成机制，可溶性rPAc表达量随之减少[11]。在本实验1～5 h的时间梯度中，IPTG诱导rPAc可溶性表达的最佳时间为4 h。同时，本实验还发现：在IPTG诱导前，菌体密度的OD600nm对后续rPAc可溶性表达量也有很大影响。大肠杆菌在OD600nm=0.6时，基本进入对数生长期，菌体生长旺盛，增殖快；对诱导表达而言，此时易于诱导合成外源蛋白。此外，IPTG的加入以及表达产物的增加对菌体生长是有影响的，所以应选在生长最旺盛的时期进行诱导表达。提前诱导菌体太少，外源蛋白产量低；而诱导太迟则细菌过老，也不利于基因表达。因此在本实验菌体密度OD600nm为0.2～1.0的梯度范围内，OD600nm=0.6时诱导获得可溶性蛋白量最多。

培养基pH值对提高大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达有明显影响，需要根据菌体和重组蛋白的特点选择合适的pH值。一般来说，pH值距重组蛋白等电点越远，表达的蛋白产物就越不容易形成包涵体（rPAc的等电点约是5.55）。李会成等[12]发现：所用工程菌的细胞生长期的最适pH值为6.8～7.4，基因表达的最适pH值为6.0～6.5。据此本实验培养基pH值的选择范围为6.4～7.4，结果表明：当pH值为7.2时rPAc可溶性表达量最高。

根据本实验结果，可以确定rPAc可溶性表达的最佳条件为：pH=7.2的LB培养基、细菌起始密度OD600nm=0.6时，用1.0 mmol·L-1的IPTG 30 ℃诱导培养4 h。本实验不仅筛选出rPAc的最佳表达条件，而且每一项因素均设置了多个变化点，绘制了rPAc表达量随不同诱导条件变化的曲线，这样在实际表达过程中，可以根据实验的经济性原则选择最佳的表达条件。虽然本文对影响rPAc可溶性表达因素的单因子作了大量的工作，但rPAc可溶性表达的工艺比较复杂，仅仅对温度、pH值等影响因素单独地加以考虑是不够的，因为各种因素之间有协同和（或）抵消作用，需要对它们进行综合考虑。下一步还需要应用能够综合反映各种因素水平间交互作用的正交设计等方法，进一步优化可溶性蛋白制备的工艺处方。

目前联合免疫策略增强防龋DNA疫苗免疫效应的机制并不明确，有待于进一步研究以促进防龋疫苗的发展。为了研究联合免疫策略以何种方式来增强DNA疫苗的免疫效应，笔者需要观察目的抗原基因在细胞内的表达定位及递呈作用过程，这些研究工作都需要高效价、高特异性的抗体。为了满足这一需求，笔者以纯化的rPAc免疫小鼠后，经亲和层析获得理想的抗rPAc抗体。Western bolt分析显示本实验所制备的抗体虽然是多克隆抗体，但是仍有很高的特异性，可以为今后深入探索“DNA初次免疫—蛋白质加强”免疫机制提供必要的工具。

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