姚超 卜令学 王科 李宁毅 王玲玲 于跃远

（青岛大学医学院附属医院 口腔颌面外科，青岛266003）

组织工程的迅速兴起为颌骨缺损的修复提供了新的方法和思路。组织工程必须具备种子细胞、支架与生长因子[1]。通常将种子细胞植入多孔支架材料中，但普通用胰酶消化的细胞的Na+/K+-ATP酶、葡萄糖转运蛋白-1（glucose transporter-1，GLUT-1）、钠-葡萄糖共转运载体-1（sodium glucose cotransporter-1，SGLT-1）、水通道蛋白等被破坏丢失，不利于其在支架上黏附、分泌细胞外基质（extracellular matrix，ECM）形成骨组织结构[2]。另外在植入过程中容易造成种子细胞丢失。笔者应用细胞片层技术获取种子细胞，既保留了细胞间的结构，又保留了细胞分泌的ECM，减少了种子细胞的丧失[3]。本实验在复合血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、重组人骨形态发生蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）的聚乳酸羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]支架材料中加入骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）细胞悬液，并在其表面包裹犬BMSCs细胞片层，然后植入犬的下颌骨缺损处，以期构建具有一定正常骨结构和功能的组织工程骨，为下颌骨缺损探讨更好的修复方法。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器设备

PLGA支架（山东省医疗器械研究所），DMEM培养液（Gibco公司，美国），rhBMP-2（Peprotech公司，美国），VEGF（Prospec公司，以色列），温度反应性培养皿（Nunc公司，丹麦），倒置相差显微镜（Olympus公司，日本），JSM-840扫描电子显微镜（JEOL公司，日本）。

1.2 实验动物

选取由青岛大学医学院附属医院实验动物中心提供的健康杂种犬16只为研究对象，12～14个月龄，体重18～23 kg，雌雄不限。由青岛大学医学院附属医院实验动物中心在相同条件下饲养。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs的获取、分离和培养 将实验犬麻醉后抽取骨髓血10 mL，密度梯度离心法分离BMSCs。将BMSCs用培养液稀释到密度为每毫升1×107个后，接种到50 mL培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。倒置相差显微镜下观察，达到80%汇合状态时，采用0.25%胰蛋白酶（含0.02%乙二胺四乙酸）消化，以1∶2比例传代。

1.3.2 BMSCs成骨诱导 将传代培养的第二代细胞加入6 mL含10%胎牛血清、成骨诱导液[4]（50 mg·L-1维生素C、10 mmol·L-1β-甘油磷酸钠、1×10-4mmol·L-1地塞米松）的DMEM高糖培养液，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中，将BMSCs向成骨细胞诱导培养。

1.3.3 BMSCs细胞片层的制备 采用胰蛋白酶消化经成骨诱导的BMSCs，在细胞计数后以每毫升1×107个的密度接种到温度反应性培养皿中，放置于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中，每3 d换液。10 d后BMSCs铺满培养皿底部，然后将培养皿放入20 ℃恒温箱中30 min，BMSCs与温度反应性培养皿底部分离形成细胞片层。

1.3.4 PLGA支架制备 将PLGA支架修整为上底长3 cm、宽1 cm；下底长2.5 cm、宽1 cm；高1 cm的多边体，并在背侧做一30 mm×3 mm×5 mm凹槽，以备嵌入下牙槽神经血管束。利用冷冻真空干燥法将0.1 μg·mL-1rhBMP-2和5 μg·mL-1VEGF复合到PLGA支架中，低温消毒后，4 ℃冰箱保存备用。

1.3.5 BMSCs接种和细胞片层包裹支架 将诱导后的BMSCs用0.25%胰酶消化，加入培养液终止消化后，1 000 r·min-1离心5 min，调整细胞密度，以细胞密度为每毫升1×107个植入到PLGA支架中，使支架完全浸湿，分为A、B组。A组在支架表面包裹2层BMSCs细胞片层，作为实验组；B组不包裹BMSCs细胞片层，作为对照组。置于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养3 d，取部分扫描电镜观察。

1.3.6 动物体内植入 将16只犬分为4组，每组4只，静脉麻醉成功后，在两侧下颌骨体下缘各做5 cm切口，切开皮肤、筋膜及肌肉，暴露下颌骨体，在两侧下颌骨体中部各做一与支架相对应的上宽下窄全层梯形缺损，以防植入体脱出，注意保留下牙槽神经血管束。左侧（实验侧）植入支架A，右侧（对照侧）植入支架B。将下颌神经血管束嵌入支架凹槽中，严密缝合软组织，对支架进一步固定。术后每只实验犬每天肌注青霉素400万U，持续7 d。

1.3.7 大体观察、影像学检查和组织学检查 术后4、8、12、16周分别处死1组实验动物，取出双侧下颌骨作大体观察。在同样投照条件下（电压：51 kV，电流：4.13 mA，时间：0.04 s，投照距离：1 m）拍摄标本X线片，用image pro plus 6.0软件分析测量光密度值。实验侧与对照侧在相同部位分别切取部分标本组织，常规脱矿，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，制作组织切片，倒置相差显微镜下观察。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行分析，对不同组同一时间点光密度值采用配对t检验，对同一组不同时间点光密度值采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 细胞培养

BMSCs接种后4 h可观察到少量细胞贴壁；接种后24 h，细胞呈不规则三角形。接种后10 d，细胞达到100%汇合状态，并呈长梭形或旋涡状排列（图1）。向成骨方向诱导后，细胞逐渐变圆，排列紧密，部分细胞重叠（图2）。

2.2 BMSCs细胞片层收获

将诱导后的BMSCs接种到温度反应性培养皿中，7～10 d后可见细胞铺满培养皿底部，细胞排列紧密，部分区域可见细胞层叠现象。将培养皿放置20 ℃环境中60 min，可见贴壁细胞从培养皿边缘处开始脱离，逐渐收缩，最终整个从培养皿底部脱离形成完整的细胞片层（图3）。

图1 原代培养的BMSCs呈长梭形或旋涡状排列 HE×100Fig 1 The primary cultured BMSCs were arranged in fusiform or swirling HE×100

图2 成骨诱导后的BMSCs细胞逐渐变圆，排列紧密HE×100Fig 2 BMSCs were changed to oblong and tightly arranged after differentiated into osteoblasts HE×100

图3 细胞片层与培养皿底部分离，悬浮于培养液中Fig 3 The cell sheet completely separated from the petri dish and floated in the culture solution

2.3 BMSCs细胞片层复合PLGA支架扫描电镜观察

电镜下观察PLGA支架呈多孔网状三维立体结构，孔径为100～300 μm。BMSCs植入及细胞片层包裹支架后3 d，可见细胞伸出多个伪足黏附在支架材料表面及孔隙中（图4）。细胞片层及分泌的细胞外基质覆盖于支架表面（图5）。

2.4 大体观察结果

16只犬全部成活并进入结果分析。术后4周，支架材料被软组织包绕，可见明显支架结构，支架与周围骨断端分界明显，触之较软。实验侧与对照侧差别不明显。术后8周，双侧仍可见部分支架轮廓，骨断端与支架结合紧密，分界不清，支架下方有少量吸收，实验侧支架吸收量少于对照侧。术后12周，实验侧骨缺损大部分被新生骨组织修复，新生骨与正常下颌骨组织之间呈骨性愈合，骨断端处未见外骨痂；对照侧下颌骨下缘处骨缺损大于实验侧。术后16周，实验侧骨缺损大部分被新生骨替代，舌侧形成与正常骨相似的密质骨，与正常骨断端骨性愈合，硬度与周围骨组织相似（图6上）；对照侧成骨量小于实验侧，下颌骨下缘处仍可见骨缺损（图6下）。

图4 细胞在PLGA支架上附着生长良好 SEM×1 000Fig 4 Good cell adhesion and growth in the PLGA scaffold SEM×1 000

图5 支架表面的BMSCs细胞片层结构 SEM×1 000Fig 5 Cell sheet microstructure on the surface of scaffold SEM×1 000

2.5 影像学观察结果

术后标本X线片光密度值见表1。由表1可见，实验侧与对照侧标本X线片光密度值随术后时间延长逐渐增加，不同时间点之间差异有统计学意义（P＜0.05）。术后同一时间点实验侧光密度值大于对照侧，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。术后16周，实验组光密度值最高，但仍低于周围正常骨组织（0.677±0.095）。植入材料8～16周可见不规则的骨小梁影，随时间增长，骨小梁增多、密集。骨断端处可见高密度骨折线（图7）。

图6 术后16周，实验侧（上）和对照侧（下）的大体观察结果Fig 6 The general observation of experimental side（up）and control side（down）at 16 weeks post-operation

表1 术后标本X线片光密度值Tab 1 The optical density of X-ray imaging after operationn＝4，±s

表1 术后标本X线片光密度值Tab 1 The optical density of X-ray imaging after operationn＝4，±s

分组0.31 4周8周12周16周实验侧 9±0.001 0.362±0.020 0.378±0.009 0.616±0.044对照侧 0.231±0.005 0.256±0.020 0.326±0.019 0.572±0.042

图7 术后16周，实验侧（上）和对照侧（下）的X线片观察结果Fig 7 The X-ray imaging of experimental side（up）and control side（down）at 16 weeks post-operation

2.6 组织学观察

植入后4、8、12、16周，两侧的组织学观察结果见图8。术后4周，实验侧可见少量新生骨组织，骨小梁纤细，可见纤维性骨痂、多核巨细胞；骨断端处纤维母细胞及新生血管较多。对照侧新生骨较实验侧少，骨小梁纤细，不规则，可见肉芽组织。

图8 植入后4、8、12、16周，实验侧和对照侧的组织学观察结果 HEFig 8 Histology observation of experimental side and control side at 4,8,12,16 weeks post-operation HE

术后8周，实验侧新生骨组织增多，骨小梁增粗，成骨活跃；髓腔周围见多个骨母细胞；骨断端处骨小梁排列紊乱，可见类骨质。对照侧成骨较实验侧少，骨小梁较细。术后12周，实验侧骨小梁较粗，增多，排列不规则，可见红骨髓，髓腔内血管丰富，周围骨母细胞多。对照侧骨小梁增多，较细，骨母细胞较实验侧少，血管较丰富。术后16周，实验侧骨小梁粗大，哈弗氏小管较丰富，周围有同心圆排列的板层样骨，骨细胞多且状态良好，可见红骨髓。骨髓腔中血管丰富，有较多钙盐沉积。对照侧骨小梁较粗，可见哈弗氏系统，但较实验侧少。

3 讨论

BMSCs可以被诱导分化成多种细胞，如成骨细胞、脂肪细胞等。由于具有这一特性，间充质干细胞已经被应用在很多领域与实验中。BMSCs只有经过特定的诱导分化，接受细胞因子的调控，合成适当的细胞外基质，才能修复病损或缺失的组织和器官，并使其具有一定的生物功能和组织结构。用BMSCs构建组织工程骨有必不可少的三要素：向成骨方向诱导分化的间充质干细胞、具有引导成骨作用的支架材料、具有诱导和调节骨形成作用的细胞因子[5]。

本实验将犬BMSCs经成骨方向诱导后植入多孔的可降解的支架材料中，并在支架表面包被BMSCs细胞片层。细胞片层技术是收获种子细胞的一种方法，可以对组织工程细胞零伤害，非蛋白酶消化，温度诱导性收获。温度反应性培养皿底部为聚异丙基丙烯酰胺水凝胶用电辐射方法结合到聚苯乙烯培养皿中制作而成的。聚异丙基丙烯酰胺水凝胶为温度反应性材料，用此培养皿培养细胞7～10 d，待细胞铺满培养皿底部后，将温度从37 ℃降到20 ℃，细胞与培养皿底部化合物之间形成一层水化膜，细胞与细胞之间连接得到保留，细胞完整地与培养皿分离形成细胞片层[6]。避免了使用胰酶分离贴壁细胞对细胞的伤害。贴壁的细胞连同细胞下层ECM一同释放出来。被完整保留的细胞下层ECM确保收获的连续细胞具有完整的细胞极性，细胞-细胞连接、细胞层-细胞层间立体连接以及细胞层与移植点之间的连接。获取细胞片层并非利用温度反应性培养皿一种方法，Nakamura等[7]曾使用细胞刮刀利用普通细胞培养皿成功获取了细胞片层，但这种细胞片层分离方式为利用细胞刮刀机械性的刮取，需要的技术性很高，较容易造成细胞损伤。由于细胞片层的诸多优势，现在已经被应用于多种研究中，Sekine等[8]成功用细胞片层技术构建出具有一定功能的管状心肌结构。Nishida等[9]利用自体口腔黏膜上皮细胞片层重建角膜组织。Zhou等[10]应用细胞片层技术构建出类似于正常骨结构的新生骨组织。本实验BMSCs片层中细胞排列致密，类似自然骨质形成过程中成骨细胞的排列形态。将成骨细胞组成的细胞片层包裹到多孔支架表面，随着成骨细胞不断的合成分泌骨基质，以及钙盐的沉积和矿化，形成了由多层同心性板层骨围绕中心哈弗氏小管和哈弗氏系统。

多孔支架材料需要提供给BMSCs一个暂时性的黏附并分泌基质的环境，所以它应具有一定的支持结构，能供细胞顺利长入的空隙。它还应具备一定的生物相容性和生物可降解性，一定的机械强度和可塑性[11]。本实验所采用的PLGA支架材料具有良好的生物相容性，可应用于临床植入。PLGA呈多孔的三维立体网状结构，空隙大小最有利于细胞和血管的生长，孔隙率为85%，利于成骨细胞的生长。相对分子质量为100 000，能够保证支架的降解速率和新生骨的生成速率基本一致。本实验将支架修整成上宽下窄的形状，并在背侧修出一个凹槽来容纳下颌神经血管束，使下牙槽动脉穿过支架内部，既保证了支架复合体的稳定，又为大块组织工程骨血供系统的构建创造了条件。

rhBMP-2是一种具有较强诱导成骨作用的生长因子，它可以单独诱导间充质干细胞向成骨细胞方向分化，是骨形成过程中最关键的调节因子。VEGF是最有效的促血管生长因子，它能够刺激血管内皮细胞的增殖和生长，促进血管的发生和血管的通透性。rhBMP-2不仅具有骨诱导活性，还能上调细胞中VEGF的表达。本实验在4～16周的标本中血管都比较丰富。应用rhBMP-2和VEGF能够有利于形成具有丰富血管支持的大块组织工程骨。

本实验应用犬BMSCs细胞片层包裹含有rhBMP-2、VEGF生长因子的PLGA支架，成功构建组织工程骨，修复下颌骨缺损。新生的组织工程骨既有骨小梁和红骨髓组成的松质骨成分，也有哈弗氏系统板层骨等密质骨成分，血管丰富，具有良好的硬度，为大块颌骨缺损的修复提供了新思路。但组织工程骨的构建仍存在诸多问题，如细胞片层技术在获取种子细胞时较困难，细胞片层覆盖支架表面不能深入内部发挥作用等尚待深入研究与解决。

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