刘小献,白俊杰,于凌云,李胜杰

(1.大连海洋大学水产与生命学院,辽宁大连116023;2.中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广州510380)

草鱼载脂蛋白A-I-1基因3'非编码区SNPs筛选及其与生长性状的关联分析

刘小献1、2,白俊杰2,于凌云2,李胜杰2

(1.大连海洋大学水产与生命学院,辽宁大连116023;2.中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广州510380)

采用PCR产物直接测序法和PCR-RFLP法对草鱼EST文库中载脂蛋白A-I-1基因(Apoprotein A-I -1,apoA-I-1)3'非编码区进行SNPs筛选,在珠江水系草鱼Ctenopharyngodon idella养殖群体144个样本中发现2个SNPs位点。C792T位点的CC型占46.53%,CT型占50.69%,TT型占2.78%;G851A位点的GG型占77.08%,GA型占20.83%,AA型占2.08%。采用一般线性模型对2个SNPs位点与草鱼4个生长性状——体质量、体长、体高和头长进行关联分析,结果表明:C792T位点TT型个体的体质量、体长、体高和头长均值高于CT型和CC型个体的生长性状指标值,但未达到显著水平(P＞0.05);G851A位点GG型个体的体质量、体长、体高和头长均值高于GA型和AA型个体的生长性状指标值,且GG型个体的体长和头长均值与GA型和AA型个体均存在显著差异(P＜0.05)。将2个SNPs位点不同基因型组合成6种双倍型,关联分析结果表明,双倍型D3(TTC792T-GGG851A)个体的体质量均值最高,D6型(CCC792TAAG851A)个体的体质量均值最低,且二者在体长、体高、头长均值间存在显著差异(P＜0.05)。推测C792T位点TT型为有利基因型;G851A位点GG型为有利基因型,AA型为不利基因型。本研究结果为草鱼分子辅助育种提供了候选标记,为加快草鱼育种进程奠定了基础。

草鱼;SNP;载脂蛋白A-I;apoA-I-1;生长性状;双倍型;关联分析

草鱼Ctenopharyngodon idella隶属于鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科、草鱼属,是中国淡水养殖四大家鱼之一,有着重要的经济价值。由于草鱼亲鱼的个体大、性成熟周期长,给其良种选育带来了困难,目前尚未获得遗传改良的品种或品系。利用DNA遗传标记进行辅助选育已成为动物育种过程中的重要方法[1]。筛选并利用与草鱼经济性状相关的分子标记,可有效提高选择效率,缩短育种年限,对加快培育具有优良经济性状的草鱼养殖品系具有重要的意义。

鱼类能量主要来源于脂类,脂类代谢在鱼类的能量代谢及生长过程中有着重要的作用。载脂蛋白A-I(Apoprotein A-I,简称apoA-I)是硬骨鱼类血浆蛋白中高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)的重要组成成分,在逆向转运胆固醇过程中具有重要作用[2],对鱼类生长存在潜在的作用。一些学者在对鲤、虹鳟和斑点叉尾鮰的研究中发现,apoA-I还存在潜在的抗菌活性,具有部分免疫功能,对鱼类的健康生长具有一定的保护作用[2-4]。本试验中,作者采用PCR产物直接测序法和PCR-RFLP法对草鱼EST文库中载脂蛋白A-I-1基因(Apoprotein A-I-1,apoA-I-1)3'非编码区SNPs位点进行筛选,以期为草鱼分子标记辅助育种提供候选标记。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用草鱼取自广东省佛山市三水白金水产种苗有限公司,为同批繁殖且同塘养殖的20月龄草

鱼群体,样本数量为144尾,体质量均值为1 292.5 g。亲本来自珠江水系。

Taq DNA聚合酶、buffer和dNTP购自华美生物工程公司,限制性内切酶BseGI和MspI购自Fermentas公司,琼脂糖、去离子甲酰胺丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺等购自广州威佳科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 采用尾静脉活体取血,抗凝剂(ACD)与血液体积比为6∶1,使用天根生化科技(北京)有限公司(TIANGEN)血液基因组提取试剂盒提取DNA,样本于-20℃下保存。

1.2.2 引物设计及合成 根据草鱼EST-SNPs数据库中apoA-I-1基因cDNA序列设计引物,扩增含SNPs位点的序列,引物序列如下:

PF:GGAGAACTGAGGAAAAAGATGACCG;

PR:TTTATTCATATCTGTGTTTGCCCATTAG,由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.3 SNPs筛选及基因型的检测 从144个草鱼DNA样本中随机挑选20个样本,用引物PF和PR对其进行PCR扩增。PCR反应体积为20 μL,包括10×PCR buffer 2.0 μL,dNTP(10 mmol/L)0.3 μL,Taq酶(5 U/μL)0.2 μL,上下游引物(20 μmol/L)各0.4 μL,基因组DNA(80 ng/μL)1 μL,ddH2O 15.8 μL。反应程序为:94℃下预变性4 min;94℃下变性30 s,56℃下退火30 s,72℃下延伸30 s,共进行32个循环;最后在72℃下延伸7 min,12℃下保存。将扩增产物在10 g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳检测。PCR产物经纯化后送广州博尚生物技术有限公司进行测序,用Vector NIT Suite 8.0软件分析测序结果,查找该片段上的SNPs位点。

1.2.4 草鱼apoA-I-1基因3'UTR序列分析 采用Vector NIT Suite 8.0软件和Clustalx 1.83软件将草鱼apoA-I-1基因3'UTR序列与GenBank中已登录的白鲢(登录号为HM124749)、稀有鮈鲫(登录号为EU327775)、花鱼骨(登录号为FJ170104, FJ170105)3种鲤科鱼类的apoA-I-1基因3'UTR序列进行分析比较。

1.2.5 采用PCR-RFLP法对SNPs位点进行分型PCR产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测后,用限制性内切酶进行酶切。酶切体系为:PCR产物0.20 μg,10×fast digest buffer 0.8 μL,限制性内切酶0.3 μL,ddH2O 6 μL。酶切产物用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(Acr与Bis的质量比为29∶1),以120 V恒压电泳1.5 h后,用银染法显色。

1.3 数据处理

采用Popgene(Version 3.2)软件分析基因型频率和等位基因频率。由于样本是同一批繁育且同池养殖,采样时间也一致,不存在时间、环境及人工饲养水平的差别,所以在建立模型时不考虑季节、环境及人工饲养技术差别,利用SPSS 15.0软件一般线性模型(General Linear Model,GLM)对SNPs位点基因型与草鱼主要生长性状之间的相关性进行最小二乘分析。统计分析模型为

Yij=μ+Bi+eij,

其中:Yij为某个性状第i个标记第j个个体的观测值;μ为试验观测所有个体的平均值(即总体平均值);Bi为第i个标记的效应值;eij为对应于观察值的随机误差效应。试验数据用平均值±标准误差表示。

2 结果

2.1 草鱼apoA-I-1基因cDNA序列及SNPs位点的初步分析

由草鱼EST文库获得草鱼apoA-I-1基因cDNA序列1 291 bp,与GenBank已登录序列分析比较,该序列含CDS序列774 bp,5'UTR序列177 bp,3'UTR序列346 bp,共编码257个氨基酸。经序列比对分析,发现在第792个碱基处(相对于起始密码子ATG)存在C-T突变,命名为C792T位点;在第851个碱基处(相对于起始密码子ATG)存在G-A突变,命名为G851A位点(图1)。

2.2 草鱼apoA-I-1基因3'UTR SNPs位点基因型的检测

采用限制性内切酶BseGI对C792T位点进行基因型分型,该314 bp序列存在2个BseGI酶切位点。经酶切,CC基因型个体具有173、105、36 bp 3条带,CT基因型个体具有173、121、105、52、36 bp 5条带,TT基因型个体具有121、105、52、36 bp 4条带,较小的片段位于图谱下方,因电泳时间长,颜色较淡,在此仅标出可鉴别基因型的173 bp和121 bp两个片段(图2)。用限制性内切酶MspI对G851A位点进行基因型分型,经酶切, GG基因型个体具有177、137 bp 2条带,GA基因型个体具有314、177、137 bp 3条带,AA基因型

个体只有314 bp 1条带(图3)。

图1 草鱼apoA-I-1基因cDNA部分序列及SNPs位点Fig.1 Partical cDNA of apoA-I-1 gene and SNPs sites in grass carp

图2 草鱼apoA-I-1基因C792T位点BseGI酶切电泳图谱Fig.2 Electrophoresis of C792T site in apoA-I-1 gene demonstrated by BseGI PCR-RFLP in grass carp

图3 草鱼apoa-I-1基因G851A位点MspI酶切电泳图谱Fig.3 Electrophoresis of G851A site in apoA-I-1 gene demonstrated by MspI PCR-RFLP in grass carp

2.3 草鱼apoA-I-1基因3'UTR SNPs位点在群体中的分布

草鱼apoA-I-1基因C792T位点和G851A位点3种基因型及其等位基因频率的统计结果见表1和表2。从表1、表2可见:在该试验群体中,C792T位点的CT型为优势基因型,等位基因C频率明显高于等位基因T,C为优势等位基因;G851A位点的GG型为优势基因型,GG型所占比例是GA型的3.7倍,G为优势等位基因。

表1 草鱼apoA-I-1基因3'UTR C792T位点在群体中的基因频率分布Tab.1 Frequencies of alleles and genotypes of C792T in 3'UTR of apoA-I-1 gene in grass carp population%

表2 草鱼apoA-I-1基因3'UTR G851A位点在群体中的基因频率分布Tab.2 Frequencies of alleles and genotypes of G851A in 3'UTR of apoA-I-1 gene in grass carp population%

2.4 草鱼apoA-I-1基因3'UTR SNPs位点与生长性状的关联分析

对两个SNPs位点不同基因型与草鱼4个主要生长性状的关联分析结果见表3。从表3可见: C792T位点TT型个体的4个主要生长性状均值最高,CT型的体质量和体高值高于CC型个体,T为有利等位基因;G851A位点GG型个体的4个生长性状均值最高,AA型个体的各项值最小,且GG型个体的体长和头长与GA型、AA型均存在显著差异(P＜0.05)。

表3 草鱼apoA-I-1基因C792T位点和G851A位点不同基因型与草鱼生长性状的关联分析Tab.3 Association of C792T site and G851A site of apoA-I-1 gene polymorphisms with growth traits in grass carp

将两个多态位点的不同基因型进行组合,得到6种双倍型(表4)。从表4可见:D3型个体的4个生长性状均值最高,D6型个体的4个生长性状均值最低。其中D3型个体的体长、体高均值显著高于D4、D6型个体(P＜0.05),D6型个体的体长均值显著低于D1～D5型个体;D3型个体的头长均值极显著高于D4、D6型个体(P＜0.01),D6型个体的头长均值显著低于D1型个体(P＜0.05)。

3 讨论

SNPs主要是指在基因组水平上由于单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,即同一物种不同个体间染色体上遗传密码子单个碱基的变化。常表现为单碱基的转换、颠换、插入和缺失[5],通常发生转换与颠换的SNPs之比为2∶1[6]。本试验中两个多态位点都属于转换,且只有两个等位基因。目前,国内外采用SNPs方法对鱼类生长方面的研究已有很多报道,Tao等[7]对北极嘉鱼Salvelinus alpinus的研究发现,GHRH/PACAP2基因上的SNPs位点与北极嘉鱼早期生长速率极显著相关; Case等[8]对大西洋鳕Gadus morhua和其它海域鳕panⅠ基因的研究结果表明,大西洋鳕panⅠ基因的变异对其生长性状有着重要的影响;Li等[9]对大口黑鲈Micropterus salmoides IGF-I基因5'非编码区进行了研究,结果表明,启动子区存在多态位

点,且与大口黑鲈的生长性状有相关性。

表4 草鱼apoA-I-1基因不同双倍型与草鱼生长性状的关联分析Tab.4 Association of apoA-I-1 gene diplotype with growth traits in grass carp

本研究中,在草鱼apoA-I-1基因的3'非编码区发现两个SNPs位点,其中C792T位点TT型个体的生长性状优于CC型和CT型个体;G851A位点GG型个体的生长性状优于GA型和AA型个体。将草鱼、白鲢、稀有鮈鲫和花鱼骨4种鲤科鱼类apoA-I-1基因3'UTR序列进行比较,发现C792T位点处存在两种碱基类型,白鲢和稀有鮈鲫的碱基为C,花鱼骨的碱基为T;G851A位点处白鲢、稀有鮈鲫和花鱼骨3种鱼的碱基类型都为G,推测草鱼C966T位点的TT型为突变型,且该突变对草鱼的生长有利,而G851A位点的AA型也为突变型,对草鱼的生长不利。

鱼类的生长性状属于数量性状,由多个基因控制,不同的SNPs位点间可能存在相互作用,由单倍型构成的双倍型基因比单个SNPs能提供更多的基因型频率信息[10]。本试验中对草鱼apoA-I-1基因不同双倍型个体与草鱼的生长性状进行关联分析,发现D3型(TTC792T-GGG851A)个体的体质量、体长和体高均值最高,D6型(CCC792TAAG851A)个体的体质量、体长和体高均值最低,可见D3型是有利基因型。由此可见,当两个位点都为有利基因型时,其生长性状均值最高;当两个多态位点中存在一个有利基因型或者两个位点都为不利基因型时,其生长性状均值最低。C792T位点的T为有利等位基因,且在群体中所占的比例不高,在草鱼的分子辅助育种中具有较大的选择潜力。在选育时可以考虑以apoA-I-1基因作为候选基因,应用于草鱼的分子辅助育种,选择C792T位点为TT型以及G851A为GG型的个体,淘汰G851A位点为AA型的个体。

目前对基因表达调控的研究主要集中在基因的5'端,其实3'端序列亦含有丰富的信息量,基因的3'非翻译区涉及了基因转录后水平的调控过程,主要参与mRNA的稳定性及降解速率、翻译时间和位点、控制翻译起始及效率等[11-14]。有关鱼类apoA-I-1基因的3'UTR调控元件的研究还很少,其区域碱基突变而引起生长性状改变的作用机理尚不清楚,还有待深入研究。

本研究中对草鱼apoA-I-1基因cDNA序列进行了分析,并在3'UTR发现了两个SNPs位点,通过一般线性模型分析,了解到这些突变位点不同基因型与草鱼的生长性状存在着一定的关联,这将有利于解决草鱼性成熟周期长等问题,并为培育出草鱼的优良品系提供参考资料。

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SNPs screening of 3'UTR in Apoprotein A-I-1 gene and its association with growth traits in grass carp

LIU Xiao-xian1,2,BAI Jun-jie2,YU Ling-yun2,LI Sheng-jie2
(1.College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China;2.Key Laboratory of Tropical&Subtropical Fishery Resource Application&Cultivation,Ministry of Agriculture,Pearl River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Guangzhou 510380,China)

Screening and genotype SNPs in 3'UTR of Apoprotein A-I-1 gene were conducted in grass carp(Ctenopharyngodon idellus)through PCR sequencing and PCR-RFLP method from EST database.Two SNPs(C792T and G851A)were obtained in the cultured population of grass carp from Pearl River.The CC genotype in C792T site was found 46.53%,CT genotype 50.69%,and TT genotype 2.78%.The GG genotype in G851A was found 77.08%,GA genotype 20.83%,and AA genotype 2.08%.A general linear model was used to analyze associations of apoA-I-1 gene with 4 major growth traits(body weight,body length,body height and head length).The results showed that the mean body weight of BB genotype was higher than that of CC and CT genotype in C792T site (P＞0.05).The mean weight,body length,body height and head length of GG genotype in G851A was higher than GA and AA genotype(P＜0.05).Six diplotypes were constructed based on two SNPs in the experimental population.The mean body weight of diplotype D3(TTC792T-GGG851A)was higher than other diplotypes.The diplotype D6 (CCC792T-AAG851A)had the minimal mean body weight,and had significant differences in body length,body height and head length(P＜0.05).TT genotype in C792T site was advantage genotype.GG genotype in G851A site was advantage genotype,and AA genotype disadvantage genotype.It is suggested that apoA-I-1 gene be a candidate modifier gene for grass carp growth traits,indicating that the apoA-I-1 gene could be useful for grass carp molecular breeding.

grass carp;SNP;Apoprotein A-I-1;apoA-I-1;growth trait;diplotype;association analysis

Q789

A

2095-1388(2012)01-0012-06

2011-04-06

现代农业产业技术体系建设专项资金资助项目(CARS-46-03);国家高技术研究发展计划项目(2011AA100403);国家科技支撑计划项目(2012BAD26B02)

刘小献(1986-),女,硕士研究生。E-mail:littlebearliu@126.com

白俊杰(1957-),男,研究员。E-mail:jjbai@163.net