王 云 ，倪 晔 *，孙志浩 ，宋 刚 ，夏子义

（1.江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122）

20世纪80年代，丙酮丁醇发酵工业曾是仅次于乙醇发酵工业的第二大发酵产业。但由于石油工业的发展，发酵法生产丙酮丁醇逐渐被淘汰。近年来，随着石油资源的短缺，原油价格的波动，发酵法生产新型生物燃料——丁醇得到广泛的关注[1-2]。国内生物丁醇的生产主要以玉米为原料，丁醇生产的原料成本占了总成本的75%，因此寻找价廉质优的非粮原料发酵生产丁醇成为一种必然趋势。

玉米秸秆是我国最为丰富的农作物秸秆之一，玉米秸秆中含有大量的纤维素类物质，包括纤维素、半纤维素和木质素[3-4]。其中纤维素和半纤维素被降解为可发酵的戊糖和己糖[5]。国内外以玉米秸秆为原料发酵生产丙酮丁醇的报道表明，利用玉米秸秆生产丙酮丁醇是可行的。2006年，Qureshi等[6]以Clostridium acetobutylicum P260为实验菌种，玉米秸秆为碳源发酵生产丙酮丁醇，当玉米秸秆水解液糖质量浓度为60 g/L并添加5 g/L木糖或木聚糖分批发酵时，总溶剂为9.60 g/L，生产强度和生产率分别为 0.20 g/（L·h）、0.41 g/g。 2009 年，王旭明等[7]利用Clostridium acetobutylicum CICC 8008为生产菌种，以NaOH预处理的玉米秸秆酶解液为发酵底物进行丙酮丁醇的发酵，丁醇质量浓度达到6.20 g/L。2010 年，Qureshi等[8]以 Clostridium beijerinckii P260为实验菌种，利用Ca（OH）2去毒处理后的玉米秸秆水解液为碳源发酵生产丙酮丁醇，获得26.27 g/L的总溶剂（丙酮 8.00 g/L，乙醇3.77 g/L，丁醇 14.50 g/L），生产强度为 0.31 g/（L·h），生产率为 0.44 g/g。 2011年 ，Lin 等[9]以 Clostridium acetobutylicum CICC 8008为生产菌种，玉米秸秆水解液为底物，采用Plackett-Burman （P-B）和 Central Composite Design（CCD）法对丙酮丁醇发酵培养基进行优化，发酵获得的最大丁醇产量为6.57 g/L。

连续发酵是指在发酵过程中以一定的速率添加新鲜培养基的同时以相同的速率放出发酵液的培养方式。与其他发酵方式相比，它缩短了发酵时间，提高了生产强度和设备利用率，便于自动化控制[10]。

国外秸秆燃料丁醇的研究生产水平已经达到甚至超过了粮食发酵水平，但国内对其研究仍处于初步阶段，溶剂生产水平较低。作者以Clostridium saccharobutylicum DSM 13864为发酵菌株，利用玉米秸秆水解液为碳源，通过正交优化实验确定了最优培养基配方，并进行了3 L发酵罐培养；同时考察了变温发酵过程对溶剂积累的影响，进行了变温连续发酵的初步研究。作者首次进行了秸秆丁醇的变温连续发酵，为实现以廉价糖质原料为底物连续发酵生产丙酮丁醇的工业化提供了依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌 种 Clostridium saccharobutylicum DSM13864：购自德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）。

1.1.2 培养基

1）种子培养基（RCM 培养基）：酵母膏 3 g/L，牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，可溶性淀粉1 g/L，葡萄糖 5 g/L，半胱氨酸盐酸盐 0.5 g/L，NaCl 3 g/L，NaAC 3 g/L，刃天青 3 mg/L；pH 6.5，115 ℃ 灭菌 20 min。

2）TYA 培养基：葡萄糖 40 g/L，牛肉膏 2 g/L，酵母膏2 g/L，胰蛋白胨6 g/L，乙酸铵3 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L；pH 6.5，115℃灭菌 20 min。

3）初始发酵培养基：玉米秸秆水解液（以总糖计 ）56.16 g/L，CaCO33.2 g/L，（NH4）2SO42 g/L，K2HPO40.5 g/L，玉 米 浆 干 粉 10 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L；pH 6.0，115 ℃灭菌 20 min。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米秸秆水解液的制备 秸秆（3 cm）于烘箱中60℃烘烤过夜，粉碎机粉碎过40目筛；70 g秸秆与1 L 1%NaOH溶液混匀，于灭菌锅中120℃处理120 min。将处理后的秸秆水洗至中性，110℃烘干，粉碎机粉碎过40目筛，得碱预处理后的秸秆。称取碱处理后玉米秸秆7 g加100 mL水，H2SO4调pH至4.8，按20 FPIU/g秸秆的量加入ZSL酸性纤维素酶 （购自山东泽生生物科技有限公司），50℃100 r/min水解72 h，离心，上清液即为玉米秸秆水解液。

1.2.2 培养方法

1）种子培养：菌种孢子液按体积分数1%转接于RCM培养基中，于真空干燥器中37℃培养12～18 h。

2）摇瓶培养：按体积分数8%将种子液接种于新鲜发酵培养基（TYA培养基、正交优化所得的最优培养基）中，250 mL三角瓶装液量为150 mL，37℃培养48 h。

3)3 L发酵罐培养：装液量1.5 L，接种体积分数8%，培养温度37℃，培养时间48 h，培养基为正交优化所得最优培养基。

4）3 L发酵罐变温调控培养：初始温度37℃；pH降至5.1时，下调温度至33℃；pH升至5.3时，下调温度至30℃，培养时间72 h。其余同3 L发酵罐培养。

5）变温发酵过程调控培养：（A）恒温37℃；（B）初始温度37℃；pH降至5.1时，下调温度至33℃；pH升至5.3时，下调温度至30℃；（C）初始温度37℃；pH降至5时，下调温度至33℃；（D）初始温度37℃；pH降至5时，下调温度至30℃。500 mL装液量300 mL，接种体积分数8%，培养基同3 L发酵罐培养 （培养基中玉米秸秆水解液糖质量浓度为56.16 g/L，添加葡萄糖使总糖达60 g/L）。

6）变温连续发酵培养：发酵罐5个，500 mL装液量为300 mL，稀释率0.1 h-1，培养基同3 L发酵罐培养。发酵开始时5个罐中均装有300 mL新鲜培养基，同时接种（接种体积分数8%），均于37℃培养至pH降至5，开始补料连续发酵，同时将后3个罐降至30℃下培养。

1.3 测定方法

1.3.1 菌体OD值测定 用1.8 g/dL稀盐酸稀释发酵液10倍（除去发酵液中的不溶物CaCO3），于分光光度计中测定660 nm下的吸光值，为菌体浓度。

1.3.2 糖含量测定 采用高效液相色谱法（HPLC）测定葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。色谱柱：Aminex HPX-87H 离子色谱柱 （300 mm×7.8 mm，9 μm； 美国Bio-Rad）；检测器：示差检测器；流动相：3 mmol/L 硫酸；流速：0.5 ml/min；柱温：55 ℃。

1.3.3 溶剂及有机酸测定 溶剂 （丙酮、 乙醇、丁醇）和有机酸（乙酸、丁酸）的测定：采用气相色谱法（GC）；色谱柱：PEG-2M 毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm×0.4 μm）；检测器：FID；载气：N2；进样量：1 μL；分流比：90∶1；内标法定量，内标为异丁醇。

2 结果与分析

2.1 Clostridium saccharobutylicum DSM 13864对玉米秸秆水解液中糖类的利用情况

秸秆水解液中主要含有葡萄糖、木糖和阿拉伯糖，作者考察了Clostridium saccharobutylicum DSM 13864对这3种糖及由这3种糖复配而成的混合糖的利用情况，以预测该菌株以玉米秸秆水解液为底物发酵生产丙酮丁醇的情况。

由表1可以看出，C.saccharobutylicumDSM13864可以分别利用木糖、葡萄糖、阿拉伯糖（糖质量浓度均为40 g/L）为底物发酵生产丙酮丁醇，产生9.04、11.80、10.02 g/L总溶剂，糖利用率分别达到80.84%，100%，100%。按照美国农业部Qureshi课题组[8]水解所得玉米秸秆水解液中木糖、葡萄糖、阿拉伯糖的组成配置的混合糖 （木糖 15.6 g/L，葡萄糖22 g/L，阿拉伯糖2.4 g/L）也能被该菌利用，产生11.61 g/L总溶剂，包括：丁醇8.42 g/L，丙酮2.81 g/L和乙醇0.38 g/L，糖利用率达100%。由此推测C.saccharobutylicum DSM 13864能够较好的利用玉米秸秆水解液来发酵生产丙酮丁醇。

2.2 发酵培养基正交优化

对初始发酵培养基中主要成分：（NH4）2SO4、CaCO3、K2HPO4和玉米浆干粉，进行了四因素三水平正交优化实验，见表2，以期获得利用玉米秸秆水解液发酵生产丙酮丁醇的最优培养基配比。根据表3中极差分析结果可知，影响丁醇积累的因素由主到次为：C>B>D>A，即玉米浆干粉＞CaCO3＞K2HPO4＞（NH4）2SO4。根据表中数据分析，培养基最优配比为C3B1D2A1，即 玉 米 浆 干 粉 15 g/L，CaCO32.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L。由于该组合在正交表中并未出现，因此在最优配比条件下进行验证实验可得总溶剂为14.97 g/L，其中丁醇10.86 g/L，丙酮3.51 g/L，乙醇0.61 g/L。确定该组合为培养基的最优配比。

表1 C.saccharobutylicum DSM 13864利用组成玉米秸秆水解液的主要糖类及其混合糖发酵产溶剂Tab.1 Production of ABE from individual sugars （glucose，xylose，arabinose） and their mixed sugars present in corn stover hydrolyzate by C.saccharobutylicum DSM 13864

表2 优化培养基配方的四因素三水平正交实验方案Tab.2 Four factorsand three levelsoforthogonal experiment on fermentation medium

表3 优化培养基配方的正交实验结果Tab.3 Results of orthogonal experiment on fermentation medium

2.3 3 L发酵罐培养

作者考察了C.saccharobutylicum DSM 13864以玉米秸秆水解液为底物，在3 L发酵罐中发酵生产丙酮丁醇过程中各参数（菌体生长、溶剂积累、有机酸产生等）的变化情况。培养基为2.2优化所得的最优培养基。由图1可知，发酵总时间为48 h，在40 h时发酵结束，总溶剂为16.1 g/L，其中丁醇10.59 g/L，丙酮 4.04 g/L，乙醇 1.46 g/L，发酵强度为0.40 g/（L·h），生产率为 0.33 g/g。 发酵 20 h 时溶剂开始迅速积累，随着溶剂的产生，有机酸（乙酸和丁酸）量减少，乙酸和丁酸转化为乙醇和丁醇。发酵初始总糖质量浓度为51.33 g/L（葡萄糖37.5 g/L，木糖12.67 g/L，阿拉伯糖1.16 g/L），随着发酵的进行，葡萄糖大量减少，阿拉伯糖于28 h耗尽，发酵末期残留2.25 g/L的木糖，结合表 1中糖利用情况，说明C.saccharobutylicum DSM 13864对木糖的代谢能力弱于葡萄糖和阿拉伯糖。

该发酵过程的初始pH为5.67，随着发酵初期有机酸（乙酸、丁酸）的产生，12 h时pH降至最低值4.99，随后发酵进入溶剂产生阶段，发酵液pH值逐渐升高，发酵末期（48 h）pH值为5.62。由于发酵液中添加了CaCO3作为缓冲物质，发酵过程最低pH为4.99；而未添加CaCO3的实验表明，发酵过程的pH可降至3.64，造成过酸环境不利于菌体生长，因而引起溶剂产量的下降，表明CaCO3是利用糖质原料进行丙酮丁醇发酵中一种重要的pH缓冲物质。

图1 C.saccharobutylicum DSM 13864利用玉米秸秆水解液在3 L发酵罐中发酵生产丁醇Fig.1 Production of butanol from corn stover hydrolyzate byC.saccharobutylicum DSM 13864in a3L bioreactor

2.4 3 L发酵罐变温调控培养

中国科学院研究所顾阳等[11]报道，在产溶剂阶段下调发酵温度，可以提高丁醇产物浓度。为了提高溶剂积累量，进行了3 L发酵罐变温调控培养（初始温度37℃；pH降至5.10时，下调温度至33℃；pH升至5.30时，下调温度至30℃）。由图 2可知，发酵进行至60 h时结束，总溶剂为17.02 g/L，其中丁醇11.90 g/L，丙酮4.61 g/L，乙醇0.51 g/L，发酵强度为 0.28 g/（L·h），生产率为 0.35 g/g。 发酵初始总糖质量分数为48.8 g/L（葡萄糖37.51 g/L，木糖10.39 g/L，阿拉伯糖 0.9 g/L），葡萄糖、木糖和阿拉伯糖分别于44、48、32 h时耗尽，糖利用率达100%。发酵过程初始pH为5.61，于24 h时下降至最低4.99，发酵末期（72 h）pH 值为 5.74。

与3 L发酵罐培养相比，发酵产溶剂阶段下调发酵温度虽然延长了发酵周期（延长了20 h），降低了发酵生产强度，但是提高了溶剂积累量和糖的利用率。因此，发酵过程变温调控可用于发酵强度比较高的连续发酵中，以提高溶剂积累量和糖利用率。

图2 C.saccharobutylicum DSM 13864利用玉米秸秆水解液在3 L发酵罐中变温调控发酵生产丁醇Fig.2 Production of butanol from corn stover hydrolyzate by C.saccharobutylicum DSM 13864 using temperature-shifting in a 3 L bioreactor

2.5 不同变温调控方式对溶剂积累的影响

为了确定合适的温度梯度，尝试了几种不同的变温调控方式。使用T检验对不同变温调控方式下的溶剂积累量和残糖进行显著性分析：A方式 （对照）与B方式（初始温度37℃；pH降至5.1时，下调温度至33℃；pH升至5.3时，下调温度至30℃）、C方式（初始温度37℃；pH降至5时，下调温度至33℃）、D方式（初始温度37℃；pH降至5时，下调温度至30℃），结果见图3。表明存在极显著性差异（P＜0.01），说明低温有利于溶剂的积累并提高糖利用率；B、C、D之间总溶剂积累量无明显差异 （P＞0.05），但是B与C、D之间丁醇积累量存在显著性差异（P＜0.01）。C方式和D方式能达到基本相同的提高丁醇积累的效果，总溶剂由17.01 g/L（其中丁醇12.01 g/L）分别提高至19.81 g/L（其中丁醇12.99 g/L）和19.98 g/L（其中丁醇13.03 g/L）。从节能方面考虑，可根据不同的季节选用C或D方式。低温虽然有利于积累溶剂和提高糖利用率，但是降低温度使细胞代谢减缓，延长了发酵周期，降低了生产强度。C方式和D方式的生产周期延长为80 h，生产强度为 0.25 g/（L·h）。

图3 不同变温调控方式对C.saccharobutylicum DSM 13864溶剂积累的影响Fig.3 Effect of different temperature-shifting operation on batch ABE fermentation by C.saccharobutylicum DSM 13864

2.6 变温连续发酵

连续发酵通过连续流加新鲜培养基并以相同的速率连续地排出发酵液而使菌体保持稳定的生长环境和生长状态，从而提高产率和产品质量。连续发酵生产丙酮丁醇不仅可以减少溶剂对菌体的毒害作用，也可以缩短发酵菌种延迟期提高丁醇的产率[10]。作者采用下进上出的五级连续发酵方式，由于丙酮丁醇发酵过程中产生大量气体（CO2和H2），在该方式下，气体产生的压力不仅可以使发酵液自发地连续不断向后流动，也可实现各罐中发酵液的搅拌混匀。在连续发酵过程的前17个小时，5个罐均处于37℃分批发酵，待各罐pH下降至5.00时，即发酵将进入产溶剂阶段，启动补料泵开始稀释率为0.1 h-1的连续发酵，同时将后3个罐移入30℃条件下发酵培养。从图4看出，该发酵过程在前80小时经历了一个不稳定阶段，原因在于补入第一个罐中的新鲜培养基要经过40 h才能到达末级罐中，即57 h后末级发酵罐才获得补料，获得补料后饥饿状态的细胞迅速增殖，产酸量增加，产溶剂量较低。连续发酵过程在80 h左右进入稳定状态并持续至269 h，稳定期平均总溶剂为12.28 g/L，其中丁醇8.50 g/L，丙酮 3.41 g/L，乙醇 0.37 g/L，发酵强度为1.23 g/(L·h)，是变温分批发酵（D 方式）的 4.92倍；平均总酸为4.42 g/L，乙酸2.97 g/L，丁酸1.45 g/L。在65 h时总溶剂达最高，为15.29 g/L（其中丁醇10.82 g/L），发酵末级罐中的平均残糖为7.33 g/L（木糖），说明发酵仍未完全结束，该连续发酵工艺仍需优化。与其他（表4）以糖质原料为底物固定化细胞或细胞循环连续发酵生产丙酮丁醇实验相比，本研究的总溶剂量有所提高。

图4 C.saccharobutylicum DSM 13864利用玉米秸秆水解液在五级变温连续发酵中末级罐的溶剂及有机酸的生产Fig.4 Time course of solvent and acids production from corn stover hydrolyzate in final stage of the fivestage temperature-shifting continuous fermentation by C.saccharobutylicum DSM 13864

表4 文献报道的连续发酵生产丙酮丁醇的数据比较Tab.4 Comparison of parameters in reported ABE continuous fermentation and this study

3 结语

C.saccharobutylicum DSM 13864可较好地利用玉米秸秆水解液中的主要糖分——木糖、葡萄糖、阿拉伯糖以及由这3种糖复配而成的混合糖为底物发酵生产丙酮丁醇。作者通过正交优化的方法确定了以玉米秸秆水解液为底物的最优培养基配比：CaCO32.0 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，玉米浆干粉 15 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L。 在该条件下进行3 L发酵罐培养，40 h时发酵结束，总溶剂为16.1 g/L，其中丁醇10.59 g/L，丙酮4.04 g/L，乙醇1.46 g/L，发酵强度为 0.40 g/（L·h），生产率为 0.33 g/g。在产溶剂阶段下调发酵温度虽然会延长发酵周期但可以提高溶剂量，降低残糖。对发酵强度较高的连续发酵进行变温调控，稀释率为0.1 h-1，80 h左右时发酵过程进入稳定状态并持续至269 h（11天），稳定期平均总溶剂为12.28 g/L，其中丁醇8.50 g/L，丙酮 3.41 g/L，乙醇 0.37 g/L，发酵强度为 1.23 g/（L·h），是变温分批发酵（D 方式）的4.92 倍。 作者对变温连续发酵生产丁醇的进行了初步实验，在工艺上仍需进一步研究和改进。以玉米秸秆水解液为底物发酵生产丙酮丁醇，对于实现可再生资源的能源化具有重要的意义，为丙酮丁醇工业化生产工艺提供了参考。

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