吕淑霞，徐 彬， 于晓丹，金雪花，林 英

（沈阳农业大学 生物科学技术学院，辽宁 沈阳110866）

细胞增生性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）属于李斯特氏菌属（Listeria），是一种重要的人畜共患病原菌，由于其在自然界分布广泛，极易通过污染食品传播，感染人和动物引起食源性李斯特菌病，使易感人群产生腹泻发热，严重的导致脑膜炎、败血症、流产等，死亡率高达20%～30%[1]。在北美平均每年有500人死于此病，因此美国和欧盟对此污染非常重视，对即食性食品检出率要求为零。传统的检测方法费时、费力且灵敏度低，多重PCR[2]、RTPCR等虽有较高的特异性和敏感性，但需要特殊的仪器设备，不适合在基层推广。此外，在基因水平食源性病原菌检测方面，死菌DNA的存在通常会导致检测结果高于样品中活菌的实际含量。因此，建立快速准确的检测方法意义极为重要。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP）是2000年开发的一种新的核酸扩增方法，针对靶基因的六个区域设计4条LAMP特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA Polymerase）在恒温条件（65 ℃左右）下保温约60 min进行扩增[3]，仅需普通水浴锅即可。叠氮溴化乙锭（ethidium bromide monoazide，EMA）作为一种DNA结合染料，能够渗透到细胞壁（膜）不完整的菌体内，在光激活的条件下，易形成氮宾化合物与DNA结合[4-5]，从而抑制死细胞DNA的扩增，而对活细胞的DNA不起作用，可以有效避免在基因检测中因死菌的存在而对样品污染活菌的高估。已有EMA-LAMP技术成功用于其他病原菌检测的报道[6-7]。作者在前人研究采用LAMP技术和建议用染料的基础上，使用叠氮溴化乙锭成功提高检测灵敏度，并且通过选择EMA浓度避免了污染性，使检测方法既快速又简易，且灵敏度高、特异性强，为食品安全该领域的检测技术提出了新方法，适合于基层使用。

1 材料与方法

1.1 材料、主要试剂与仪器

1.1.1 实验菌株 本研究共采用9株菌株，其中包括2株单增李斯特菌标准菌株ATCC19111和ATCC19115（阳性菌株），7株非单增李斯特菌（阴性菌株），均为作者所在实验室保存。

1.1.2 主要试剂和仪器 EMA、betaine：美国Sigma公 司 ；dNTPs、DL2000 DNA Marker、LAMP 引 物 ：TAKARA宝生物（大连）工程有限公司；Lysozyme：宝泰克生物科技公司；Proteinase K：Roche公司；Bst DNA Polymerase，Large Fragment：New England Biolabs公司；电泳仪水平板电泳槽及附件JY600C：北京君意东方电用仪器有限公司；凝胶成像系统UNIVERSAL HOODⅡ-S.N.76S/03822：Bio-Rad 公司；500 W 卤钨灯：沈阳艺沈器化玻站；立式压力蒸汽灭菌锅LDZX-30KBS：上海申安医疗机械厂；数显恒温水浴锅HH-4：国华电器有限公司；移液枪：Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 单增李斯特菌的培养和处理 将单增李斯特菌ATCC19111接种于胰酪胨大豆酵母浸膏培养基（TSA-YE）中，过夜培养（37 ℃、160 r/min）。取 10 mL对数生长期的菌悬液于10 000 r/min离心1 min。菌悬浮在10 mL 0.85%的生理盐水中，10 000 r/min离心1 min。生理盐水稀释使菌浓度为2.0×108CFU/mL，菌悬液留作检测用。

1.2.2 LAMP反应引物设计与合成 根据GenBank数据库中的单增李斯特菌hly基因序列，利用在线LAMP引物设计软件PrimerExplorer V4进行分析，在其保守序列中的六个不同位点设计了4条引物：外引物 hly-F3、hly-B3，内引物 hly-FIP、hly-BIP。 内引物hly-FIP由F1C通过TTTT连接物与F2相连而组成，内引物hly-BIP为B1C通过TTTT连接物与B2相连而组成。引物委托TAKARA宝生物（大连）工程有限公司合成。引物设计原理见图1，引物序列见表1。

图1 LAMP引物设计原理Fig.1 Schematic representation of the primer design for EMA-LAMP assay

表1 LAMP引物序列Tab.1 Nucleotide sequence of primer sets designed for EMA-LAMP assay

1.2.3 模板DNA的提取 取菌浓度为2.0×108CFU/mL的菌悬液500 μL于1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心5 min，弃上清液，收集菌体；向每管加入90 μL ddH2O 重悬，加入 6 μL Lysozyme（50 mg/mL），用枪头混匀，37℃温浴15 min；加入4 μL Proteinase K（20 mg/mL），振荡数秒，置于58℃恒温水浴锅内孵育45 min；接着95℃加热8 min，使酶失活；12 000 r/min离心5 min，取上清液备用。

1.2.4 LAMP反应体系与产物检测 LAMP反应总体积为 25 μL： 0.2 mmol/L 的 hly-F3 和 hly-B3，0.8 mmol/L 的 hly-FIP 和 hly-BIP，4mmol/L 的MgSO4，1 ×ThermoPol Reaction Buffer （20 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L KCl、10 mmol/L （NH4）2SO4、2 mmol/L MgSO4、0.1%Triton X-100，pH 8.8，25 ℃），1.6 mmol/L 的 dNTPs，1 mol/L 的 betaine，8 U Bst DNA Polymerase，2 μL 模板 DNA， 加 ddH2O 至 25 μL。轻弹混匀，63℃恒温反应1 h后，80℃灭活10 min。同时设立阴性对照，用ddH2O取代模板DNA，其它反应条件不变。取3 μL反应产物与1 μL 6×Loading Buffer混匀后点样于1 g/dL琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）中，150 V电泳35 min后于凝胶成像系统中成像，观察扩增产物是否呈阶梯状条带。如果为阳性反应，则产生典型的阶梯状条带，如果为阴性反应，则无条带产生[8-9]。

1.2.5 热处理杀死菌细胞 取0.85%的生理盐水处理的500 μL菌悬液放于1.5 mL离心管中，95℃水浴8 min。待菌悬液冷却至室温，涂平板，置于37℃培养箱中培养24 h，以确保热处理的菌被完全杀死。

1.2.6 EMA-LAMP检测的特异性试验 用ddH2O溶解EMA，配制成1 mg/mL母液，用锡箔纸包裹置于-20℃备用。EMA为致癌物质，操作时注意安全。取20 μL质量浓度为0.1 mg/mL的EMA溶液分别加入含有500 μL菌浓度为2.0×108CFU/mL的单增李斯特菌ATCC19111和ATCC19115以及7株非单增李斯特菌的离心管中，混匀并于黑暗下室温放置5 min，后放在冰上，每5分钟补充一次冰，距500 W卤钨灯16 cm，曝光20 min。按照1.2.3方法提取DNA，作为LAMP反应的DNA模板进行LAMP扩增和电泳检测，验证其特异性。

1.2.7 不同浓度EMA对死菌DNA的LAMP扩增影响 分别向含有浓度为2.0×108CFU/mL的500 μL热杀死菌悬液中加入浓度为0.1 mg/mL的EMA溶液，使 EMA 的终质量浓度分别为 0、0.2、0.4、0.8、2.0、4.0、8.0、10 μg/mL， 混匀并于黑暗下室温放置 5 min，后放在冰上，每5 min补充一次冰，防止温度升高，距500 W卤钨灯16 cm，曝光25 min。按照1.2.3方法提取DNA，作为LAMP反应的DNA模板进行LAMP扩增和电泳检测。

1.2.8 不同浓度EMA对活菌DNA的LAMP扩增影响 分别向含有浓度为2.0×108CFU/mL的500 μL活菌悬液中加入1 mg/mL的EMA母液，使EMA终质量浓度分别为0、2.0、4.0、8.0、10、20、40、80 μg/mL，混匀并于黑暗下室温放置5 min，然后放在冰上，每5分钟补充一次冰，距500 W卤钨灯16 cm，曝光25 min。按照1.2.3方法提取DNA，作为LAMP反应的DNA模板进行LAMP扩增和电泳检测。

1.2.9 EMA曝光时间的优化 取20 μL质量浓度为0.1 mg/mL的EMA溶液，分别加入含有500 μL菌浓度为2.0×108CFU/mL的活菌和热杀死菌的离心管中，混匀并于黑暗下室温放置5 min，然后放在冰上，每5分钟补充一次冰，距500 W卤钨灯16 cm， 曝光时间分别为 0、1、5、10、15、20 min。 按照1.2.3方法提取DNA，作为LAMP反应的DNA模板进行LAMP扩增和电泳检测。

1.2.10 EMA-LAMP检测的灵敏度试验 取20 μL质量浓度为0.1 mg/mL的EMA溶液，分别加入含有500 μL 菌浓度依次为 2.0×107、2.0×106、2.0×105、2.0×104、2.0×103、2.0×102、2.0×101、2.0×100CFU/mL的活菌悬液的离心管中，混匀并于黑暗下室温放置5 min，后放在冰上，每5分钟补充一次冰，距500 W卤钨灯16 cm，曝光20 min。按照1.2.3方法提取DNA，作为LAMP反应的DNA模板进行LAMP扩增和电泳检测，检测其灵敏度。

2 结果与分析

2.1 EMA-LAMP检测的特异性评价

EMA-LAMP方法检测结果显示，两株单增李斯特菌标准菌种均出现LAMP的特征性条带，而7株非单增李斯特菌及阴性对照均未出现LAMP条带。上述结果表明，EMA-LAMP方法检测单增李斯特菌具有很好的特异性，见图2。

图2 EMA-LAMP的特异性检测结果Fig.2 Specificity of amplification results by EMA-LAMP

2.2 抑制死菌DNA的LAMP扩增的最小EMA质量浓度

不同浓度EMA处理菌浓度为2.0×108CFU/mL的热杀死的单增李斯特菌后，LAMP反应可扩增出特异性的阶梯状条带，EMA质量浓度在0.2～2 μg/mL内，扩增产物的电泳条带逐渐减弱；当EMA质量浓度大于等于4 μg/mL时，无扩增产物出现。因此抑制死菌DNA的LAMP扩增的最小EMA质量浓度为 4 μg/mL，见图 3。

图3 不同质量浓度EMA对死菌DNA的LAMP扩增影响Fig.3 Effect of the differential concentration of EMA on the LAMP for DNA from heat killed bacterial cells

2.3 不抑制活菌DNA的LAMP扩增的最大EMA质量浓度

不同浓度EMA处理菌浓度为2.0×108CFU/mL的单增李斯特菌活菌细胞后，LAMP反应都能扩增出特异性的阶梯状条带，EMA质量浓度在2～10 μg/mL内，扩增产物的电泳条带几乎无变化；EMA质量浓度在10～40 μg/mL时，扩增产物的条带逐渐减弱；但当EMA质量浓度大于等于80 μg/mL时，无扩增产物出现；所以不抑制活菌DNA的LAMP扩增的最大EMA质量浓度为10 μg/mL，见图4。因此作者采用质量浓度为4 μg/mL的EMA检测单增李斯特菌活菌细胞。

图4 不同质量浓度EMA对活菌DNA的LAMP扩增的影响Fig.4 Effect of the differential concentration of EMA onthe LAMP for DNA from viable bacterial cells

2.4 EMA激活光解的最佳曝光时间

利用 4 μg/mL EMA处理 菌浓度为 2.0×108CFU/mL的单增李斯特菌活菌细胞，在500 W卤钨灯下曝光0～20 min，LAMP反应均能够扩增出特异性的阶梯状条带且条带亮度几乎无变化，所以EMA的曝光时间对活菌DNA LAMP扩增无影响，见图5。

图5 EMA的曝光时间对活菌DNA LAMP扩增的影响Fig.5 Effect of the light exposure time on achieving complete photolysis of free EMA in suspensions of viable bacterial cells

同样，利用4 μg/mL EMA处理菌浓度为2.0×108CFU/mL的热杀死的单增李斯特菌，在500 W卤钨灯下进行曝光0～20 min，LAMP反应能够扩增出特异性的阶梯状条带；曝光时间在0～10 min，扩增产物的条带逐渐减弱；当曝光时间为15 min时，条带明显减弱；当日落光时间为20 min时，没有扩增条带。所以EMA激活光解的最佳曝光时间为20 min，见图6。因此作者建立EMA-LAMP鉴别检测单增李斯特菌死活菌细胞时，确定EMA曝光时间为20 min。

2.5 EMA-LAMP检测的灵敏度评价

随着活菌细胞数目的减少，LAMP的阶梯状条带也逐渐减弱，到活菌浓度为2.0×100CFU/mL时，不再出现LAMP条带，因此EMA-LAMP方法检测活的单增李斯特菌的检出限是20 CFU/mL，见图7。

3 结语

本研究表明：抑制活菌LAMP扩增的EMA质量浓度要大于10 μg/mL，与Lee和Levin[10]研究的抑制活菌PCR扩增的结果相符。抑制死菌LAMP扩增的最小EMA质量浓度为4.0 μg/mL。Gu和Levin[11]研究的抑制类志贺单胞菌死菌细胞的最小EMA质量浓度为 1.0 μg/mL，Lee 和 Levin[10]研究的抑制死菌PCR扩增的最小EMA质量浓度为0.8 μg/mL，Wang和Levin[12]研究的抑制死菌PCR扩增的最小EMA质量浓度为2.5 μg/mL。因此EMA-LAMP检测某种食源性致病细菌死活细胞时，必须选择最佳EMA质量浓度。试验结果证明4.0 μg/mL足以抑制2.0×108CFU/mL死菌细胞的扩增，而对活菌细胞的扩增无影响。

图6 EMA的曝光时间对死菌DNA LAMP扩增的影响Fig.6 Effect of the light exposure time on activating the DNA-bound EMA and on achieving complete photolysis of free EMA in suspensions of heat killed bacterial cells

图7 EMA-LAMP的灵敏度检测结果Fig.7 Sensitivity of amplification results by EMA-LAMP

利用EMA与LAMP检测相结合的技术，不仅可以有效区分单增李斯特菌病原菌的死活细胞，而且检测单增李斯特菌活菌细胞的灵敏度可达到20 CFU/mL。同时，EMA-LAMP法与 EMA-PCR法、EMA-实时荧光PCR等[13-15]相比，不需要使用PCR等昂贵、精密的仪器设备，避免了DNA的热变性、长时间的温度循环等步骤，反应更迅速、操作更简便、检测成本更低，为单增李斯特菌的快速鉴别检测提供了新的发展方向，有望成为简易的常规检测手段，尤其适用于基层检测和现场检测。

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