徐文娟，罗和生，梁成柏，刘 颖，夏 虹

武汉大学人民医院消化内科，湖北武汉430060

促甲状腺激素释放激素(TRH)是从下丘脑中分离和提纯的化学结构为焦谷氨酰-组氨酰-脯氨酰胺的三肽激素，在垂体前叶细胞上有TRH特异性受体，脑室内注射TRH后，可引起近端十二指肠基本电节律的振幅增加，频率减少，并且几乎每一周期的基本电节律均伴有锋电位的爆发，但对远端十二指肠、空肠和回肠的肌电图没有影响［1］。近年研究发现TRH在胃肠道中广泛分布，用放射免疫组织化学法显示TRH在胰腺、盲肠和胃底中含量最高［2］，已有TRH对大鼠离体胃窦肌条、幽门括约肌和结肠机械活动作用的研究报道，发现TRH不影响这三种组织的收缩频率，但明显加强它们的收缩幅度［3］。而TRH对离体十二指肠实验显示，TRH可使十二指肠平滑肌舒张，但作用短暂，并且该作用不被TTX阻断，提示TRH不需要肠内在神经丛的参与可直接影响平滑肌收缩［4］。研究报道，TRH能降低大鼠腺垂体GH3/B6细胞快速延迟整流钾通道(ether-à-go-go related gene，egr)电流，并能调节erg1、erg2、erg3和HERG的表达［5］。本实验采用全细胞膜片钳技术观察TRH对单个结肠平滑肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)和延迟整流钾电流(Ik)的影响，从离子通道水平探讨TRH对胃肠动力的作用机制。

1 材料与方法

1．1 试剂和仪器 Ⅱ型胶原酶和牛血清白蛋白购自GIBCO公司，胰蛋白酶抑制剂购自AMRESCO公司，TRH、HEPES、NaCl、KCl、CaCl2、葡萄糖等均购自美国Sigma公司。法国Millipore公司Milli-Q Plus纯水机，德国HEKA公司EPC10膜片钳放大器，日本Olympus公司IX71倒置显微镜，德国 List Electronics公司 L/ M-sps-8型8通道灌流系统，美国Sutter科学仪器公司P97膜片钳微电极拉制仪，瑞士 Mettler Toledo公司AB-104电子天秤和DELTA 320 pH计。

1．2 主要溶液 台氏液(mmol/L):NaCl 147，KCl 4，CaCl22，NaH2PO40．42，Na2HPO42，MgCl21．05，Glucose 5．5，以NaOH调pH 7．4;Ca-free PSS(mmol/L): NaCl 134．8，KCl 4．5，HEPES 10，MgCl21，Glucose 10，以Tris调pH 7．4;记录钾电流的电极内液成分(mmol/ L):天冬氨酸110，Mg-ATP 5，HEPES 5，MgCl21，KCl 20，EGTA 10，CdCl21，di-tris-creatinephosphate 2．5，disodium-creatine phosphate 2．5，以KOH调pH 7．3;记录钾电流的细胞外液为台式液。

1．3 单个大鼠结肠平滑肌细胞的分离 取成年雄性Wistar大鼠，体质量200～250 g，颈椎脱臼处死，剪开腹腔，取近端结肠约5 cm，在氧饱和无钙PSS中小心洗净肠内容物，沿纵轴剖开，将结肠固定于硅胶板上。在解剖显微镜下小心地分离黏膜层和黏膜下层得到肌条。将肌条剪成2 mm×4 mm小块，4℃无钙PSS保存10 min。用含1%Ⅱ型胶原酶、1%胰蛋白酶抑制剂、2%牛血清白蛋白的消化液于37℃消化15 min左右，再用无钙PSS冲洗3次洗净消化酶后置于4℃冰箱备用，实验前用吸管反复吹打直至液体变浑浊，取上清液即可得单个大鼠结肠平滑肌细胞。

1．4 Ito和Ik的记录 取细胞悬浮液约1 mL置于倒置显微镜下，静置10 min，待细胞完全贴壁后，用含钙的台氏液进行灌流(3 mL/min)，选择边缘整齐、表面光滑无颗粒、无收缩的细胞备用。经微电极拉制器二步拉制成尖端为1～1．5 μm的电极，充灌记录钾电流的电极内液。电极入水后电阻为3～5 MΩ，补偿液接电位，调节三维操纵器使电极尖端移向细胞表面，再行封接，封接电阻达1 GΩ以上，补偿快电容并吸破细胞膜形成全细胞模式。在－80 mV电压钳制下，以20 mV为阶跃，给予步阶刺激从－80 mV到+60 mV，时程700 ms，记录Ito和Ik脉冲电流，由德国HEKA公司Pulse软件控制，经EPC-10放大器放大后，通过AgCl电极丝和填充电极内液的玻璃微电极导入细胞，产生的电流信号经EPC-10放大器转换，由Pulse软件收集并存储于计算机的硬盘中。在细胞外液中加入不同浓度的TRH，记录其对Ito和Ik的影响。

2 结果

2．1 TRH对大鼠结肠平滑肌细胞膜Ito的影响 采用全细胞膜片钳记录方式研究TRH对大鼠单个结肠平滑肌细胞膜Ito的作用，在细胞外液中定量加入TRH，使其终浓度分别为10、20、50、100 μmol/L，实验表明TRH能浓度依赖性抑制大鼠单个结肠平滑肌细胞膜Ito(n=12，P＜0．05)。将细胞钳制在－80 mV，阶跃20 mV，逐级去极化至+60 mV，可见一系列呈电压和时间依赖性的外向钾电流，其激活电位为－40 mV。分别向细胞外液中加入10、20、50、100 μmol/L TRH，观察到在不同指令电压水平，TRH 10、20、50、100 μmol/L均使Ito减小，当阶跃刺激为+60 mV时，对照组、10、20、50、100 μmol/L TRH组的Ito分别为(1 368．3±43．0)pA、(1 185．2± 78．2)pA、(985．2±46．4)pA，(828．3±58．9)pA、(637．1 ±25．6)pA，10、20、50、100 μmol/L TRH组的Ito与对照组相比，分别降低了13．4%、28．0%、39．5%、53．4%，差异有统计学意义(n=12，P＜0．05)(见图1A)。在上述条件下，以不同电压水平的Ito和相应的电压绘制不同浓度TRH电流-电压曲线，可见在－40 mV电流激活以后10、20、50、100 μmol/L TRH均使Ito的电流-电压曲线下移，并呈现浓度依赖性，但不使电流-电压曲线峰值偏移(见图1B)。

图1 A:不同浓度TRH对Ito的影响;B:不同浓度TRH对Ito电流-电压曲线的影响Fig 1 A:Effects of TRH on Ito;B:Effects of TRH on I-U curve of Ito

2．2 TRH对大鼠结肠平滑肌细胞膜Ik的影响 采用全细胞膜片钳记录方式研究TRH对大鼠单个结肠平滑肌细胞膜Ik的作用，实验表明TRH对大鼠单个结肠平滑肌细胞膜Ik无影响(n=12，P＞0．05)。在－80 mV钳制电压下，阶跃20 mV，逐级去极化至+60 mV，可见一系列呈电压和时间依赖性的外向钾电流，其激活电位是－40 mV。当阶跃刺激为+60 mV时，对照组Ik为(792．7±73．5)pA，100 μmol/L TRH组的Ik为(809．8±58．0)pA，与对照组相比，升高2．2%，差异无统计学意义(n=12，P＞0．05)(见图2A)。在上述条件下，以不同电压水平的Ik和相应的电压绘制100 μmol/L TRH的电流-电压曲线，可见在－40 mV电流激活以后TRH对Ik的电流-电压曲线无明显改变(见图2B)。

图2 A:100 μmol/L TRH对Ik的影响;B:100 μmol/L TRH对Ik电流-电压曲线的影响Fig 2 A:Effects of TRH on Ik;B:Effects of TRH on I-U curve of Ik

3 讨论

在胃肠道平滑肌里存在的主要电压依赖性离子通道有电压依赖性钙通道、延迟整流钾通道、钙敏感钾电流通道、瞬时外向钾电流(Ito)通道，又称A型电流等。钾通道一般被膜电位去极化和/或胞内钙离子激活，使钾离子外流引起膜电位超极化抑制平滑肌收缩，导致平滑肌舒张。神经递质和胃肠道激素通过受体和第二信使系统作用于离子通道，从而对肠道平滑肌电生理和收缩活动进行调节。

TRH主要存在于丘脑下部正中隆起，中枢神经系统以外主要存在于胃肠道和胰腺中，作为一种脑肠肽，其对胃肠道的分泌、消化和运动功能及摄食活动等有广泛的影响。TRH通过与细胞膜表面TRH受体结合发挥其生物学效应，TRH受体属于G蛋白偶联受体(GPCR)超家族［6］。Miranda等［7］采用穿孔膜片钳研究TRH受体对大鼠腺垂体GH3细胞r-ERG的调节，发现Gq/11蛋白不参与TRH对内源性r-ERG电流的抑制作用，而βγ二聚体从G蛋白的释放调节TRH对ERG的触发。erg K+通道在胃肠道的电活动中扮演了重要的角色-调节胃肠道平滑肌慢波电位发生的频率和持续的时间［8］。

Ik影响膜的静息电位、动作电位阈值和慢波的波形，可调节刺激引发的电反应。Ito因其激活、失活以及从稳态失活的复活过程都很迅速而得名，是动作电位潜伏期外向电流的主要成分，主要调节静息膜兴奋性，减慢去极化速度，延缓动作电位的产生。因此Ito的变化对细胞的兴奋性具有重要的影响。目前已明确有两种类型的Ito，一种为对4-AP敏感而对钙不敏感的钾通道，称为Ito1;另一种为钙依赖性的氯通道，称为Ito2，能被caffeine、Co2+阻断。本研究中所用电极液中含高浓度的钙络合剂EGTA(10 mmol/L)和钙通道阻断剂CdCl2(1 mmol/L)，因此，本研究记录的瞬间外向钾电流是Ito1而不包含Ito2。

本实验研究通过TRH对Ito和Ik的作用显示10、20、50、100 μmol/L TRH能明显抑制Ito，并呈现浓度依赖性，在指令电压为+60 mV时，电流达峰值，与用药前比较其峰值明显减少，100 μmol/L TRH可使峰值明显降低，说明TRH可阻滞大鼠结肠平滑肌细胞Ito;而当指令电压为+60 mV时，100 μmol/L TRH对Ik的作用不显著，表明TRH对大鼠结肠平滑肌细胞Ik无抑制作用。

研究报道，TEA敏感的Ik对小鼠结肠平滑肌细胞动作电位幅度起决定作用，该电流增加峰电位幅度，但对基础电节律无影响。而4-AP敏感的Ik改变慢波节律，产生连续峰电位，它决定峰电位的爆发，并认为该电流的电生理特性类似于神经和其他平滑肌细胞上的A型电流［9］。本实验结果表明TRH抑制钾电流的作用不是通过Ik，而与Ito通道有关。分子生物学研究已证明，Kv 1．4、Kv 4．2和Kv 4．3克隆与Ito有关，Kv通道互作蛋白(KChIPs)对通道的表达和功能起重要作用。Amberg等［10］研究表明Kv 4．3是小鼠结肠平滑肌细胞钾电流的主要表达分子，Kv 4．3与KChIP1可能增加Ito表达的幅度和密度，对Ito起决定作用。同样也有研究报道，雌激素不影响小鼠结肠细胞Ik，但能抑制A型电流，调节细胞的兴奋性，并且在雌激素降低A型电流组中发现，Kv 4．3的转录与对照组相比无明显变化，而KChIP1在去卵巢组明显升高，说明雌激素对结肠动力的调节与KChIP1介导的A型电流有关［11］。因此推测TRH抑制结肠平滑肌细胞膜Ito是否也与Kv 4．3和KChIP1有关，还需更多的研究证明。

同时本实验中TRH对Ik无明显作用，而Schledermann等［5］研究表明，TRH可减少垂体前叶erg电流，并且TRH影响erg1通道的过度表达不通过任何已知的信号通路介导。TRH对Ik的这种差异可能是由于种属及组织特异性造成的。此外，由于TRH对Ito的显著作用，而对于所有的种属，在考虑Ito变化对动作电位形态的净作用时尤其要考虑的两种电流是 ICa-L和INa/Ca，因为它们在决定收缩力、产生节律失常如早后除极和迟后除极中发挥重要作用［12］。已有研究报道TRH通过水解磷酸肌醇经IP3和PKC途径提高胞内游离钙浓度参与钾电流的调节，钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ和钙调磷酸酶在结肠平滑肌细胞Ito的失活中起重要作用［13-15］，但TRH经受体介导细胞内一系列信号级联系统影响Ito，其具体机制需进一步实验以阐明。

本研究结果表明，TRH可浓度依赖性抑制大鼠结肠平滑肌细胞的Ito，不能降低Ik，因此，TRH可能通过阻滞Ito通道钾离子外流改变动作电位潜伏期外向电流，加快去极化速度，从而调节细胞的兴奋性影响平滑肌的收缩，这可能是TRH改变胃肠道动力的机制之一，同时是否还有其他机制的参与，还需进一步的研究探讨。

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