邹 荣，于红刚，周 巍

武汉大学人民医院消化内科，湖北武汉430060

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤，其浸润和转移是影响患者疗效及预后并导致死亡的重要因素，因此，探讨胃癌的侵袭和转移是目前研究工作的一个重要方面。与张力蛋白同源的第10号染色体丢失的磷酸酶基因PTEN是一种具有双重磷酸酶活性的抑癌基因，PTEN基因的突变、缺失、失活在原发性和转移性肿瘤中发生率较高，失活是因为启动子甲基化沉默导致的［1］。Paxillin是一种黏着斑信号蛋白，作为一种接头蛋白在细胞内发挥作用，主要参与肿瘤的侵袭和转移［2-3］。目前国内外将PTEN与paxillin联合起来研究的文章并不多，且采用免疫印迹和免疫荧光技术探讨PTEN与paxillin的关系更是少见，本文通过此两种研究方法探讨PTEN与paxillin在胃癌发生、发展中的作用，为寻求新的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料及试剂 人胃癌细胞株BGC823(购于上海中科院)，胎牛血清(GIBCO公司)，1640(GIBCO公司)，RIPA裂解液(碧云天生物技术有限公司)，小鼠抗人paxillin单克隆抗体(购于ABcom公司)，小鼠抗人PTEN单克隆抗体(购于美国Santa Cruz公司)，兔抗人β-actin单克隆抗体(购于美国Santa Cruz公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG(购于美国Santa Cruz公司)，质粒抽提试剂盒(OMEGA公司)，碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)。质粒pEAK8和pEAK8-PTEN由李宏宇教授(沈阳军区总医院消化科)惠赠。

1．2 方法

1．2．1 瞬时转染质粒pEAK8及pEAK8-PTEN:以大肠杆菌E．coli为载体扩增质粒，按照质粒抽提试剂盒说明书提取质粒，于紫外分光光度计下测定质粒浓度，细胞饥饿12 h后，利用脂质体介导法将质粒和脂质体(LipofectamineTM2000，购于invitrogen公司)按说明书操作加入到培养瓶，细胞培养48 h后提蛋白。

1．2．2 Western blot检测PTEN、paxillin及actin(内参)蛋白水平的表达:BCA法测定蛋白浓度。加入上样缓冲液后煮沸蛋白使蛋白变性;10 μg体积的蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白湿转至硝酸纤维素膜上;10%脱脂牛奶封闭;一抗(小鼠抗人PTEN单克隆抗体1∶750稀释、小鼠抗人paxillin单克隆抗体1∶1 000稀释、兔抗人β-actin单克隆抗体1∶1 000稀释)4℃孵育过夜;TBST洗5 min，3次;二抗(HRP-偶联的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG)孵育1 h(1∶1 500稀释);TBST洗3次，每次10 min;化学发光法定影显影后用数码成像系统对胶片进行扫描，利用Quanity One软件对条带的灰度值进行分析。

1．2．3 免疫荧光检测paxillin在细胞内的定位:将瞬转pEAK8和pEAK8-PTEN质粒的BGC细胞以3×105种入置有盖玻片的六孔板内培养至细胞融合达60%～70%，4%多聚甲醛固定30 min后去固定液，PBS洗涤3次;加入0．2%Triton 100(透膜)静置10 min，PBS洗涤3次;5%BSA封闭30 min;一抗(小鼠抗人paxillin单克隆抗体1∶100稀释)4℃孵育过夜;PBS洗3次;二抗(TexRed荧光标记，购自Santa Cruz公司)孵育1 h;PBS洗5 min，3次;DAPI(Santa Cruz公司)染色2 min;PBS洗5 min，3次。荧光显微镜下观察。

1．3 统计学分析 采用SPSS 13．0统计软件对数据进行处理，不同组间灰度值差异可用单因素方差分析检验，PTEN与paxillin的相关关系用Spearman秩相关进行分析，检验水准α=0．05，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 W estern blot检测 如图1所示，胃癌细胞中实验组［pEAK8-PTEN-BGC823(pE-P-B)］与对照组［空白对照BGC823(BGC823)、阴性对照pEAK8-BGC823 (pE-B)］相比，PTEN蛋白水平的表达明显升高，而paxillin蛋白的表达明显受到抑制。表1中各组数据以均数±标准差(±s)表示，实验组与对照组差异均有统计学意义(P＜0．05)，空白对照与阴性对照组中PTEN与 paxillin的表达差异无统计学意义(P＞0．05)。PTEN与paxillin两者呈负相关(r=－0．12，P＜0．05)。actin用于显示上样量一致。

图1 W estern blot检测PTEN、paxillin、actin蛋白的表达Fig 1 The protein expression of PTEN，paxillin and actin detected by W estern blot

表1 PTEN和paxillin蛋白的表达(±s)Tab 1 The protein expression of PTEN and paxillin(±s)

表1 PTEN和paxillin蛋白的表达(±s)Tab 1 The protein expression of PTEN and paxillin(±s)

分组PTEN Paxillin BGC 0．506±0．015 2．663±0．096 pE-B 0．513±0．006 2．747±0．047 pE-P-B 1．013±0．074 0．883±0．032

2．2 免疫荧光 如图2所示:胃癌细胞核呈蓝色，paxillin位于细胞膜上呈红色(箭头所示)，在细胞伸出伪足处聚集。

3 讨论

PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)基因是1997年发现并命名的一个抑癌基因，定位于染色体10q23，具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性。其主要功能是通过脂质磷酸酶活性调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/AKT，PI3K/AKT)通路活性，而PI3K/AKT信号传导通路的激活被认为是肿瘤细胞抗凋亡的主要机制之一。其蛋白磷酸酶活性可使粘着斑激酶(focal adhesional kinase，FAK)蛋白去磷酸化继而抑制细胞的运动和侵袭能力［2，4］。PTEN蛋白可通过多种信号途径调控细胞的增殖、凋亡、运动、侵袭、转移等多种生物学行为［5-7］。PTEN基因在多种恶性肿瘤中可发生突变和缺失，导致肿瘤细胞运动、侵袭和转移能力增强［8-10］。在神经胶质瘤、子宫内膜癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等都有检测到PTEN基因的突变和缺失。本研究结果显示:转染质粒GFP的BGC细胞与空白对照BGC细胞相比，PTEN与paxillin蛋白水平的表达无明显差异，说明GFP质粒对胃癌细胞中的蛋白的生成未产生明显影响，只是使细胞能发出绿色荧光;共转质粒GFP与PTEN的BGC细胞PTEN的表达明显高于阴性对照组GFP-BGC细胞和空白对照组BGC细胞，而paxillin的表达明显低于后两者，表明PTEN可下调胃癌细胞中paxillin的表达，与杨丽敏等［11］研究发现PTEN与paxillin的表达呈负相关结论相同。

图2 免疫荧光检测paxillin在细胞内的定位(400×)a、c、e:pEAK8-BGC823;:b、d、f:pEAK8-PTEN-BGC823Fig 2 The location of paxillin inside cell detected by immunofluorescence(400×)

paxillin是一个分子量为68 KD的黏着斑信号蛋白，是一种重要的细胞黏附分子，主要定位于黏着斑。paxillin分子中含有多种结构域，包括氨基端起蛋白识别作用的5个LD结构域和富含脯氨酸的SH3结构域;羧基端介导蛋白与蛋白之间的相互作用的4个串联的LIM结构域，这些结构使paxillin能够和一系列的信号蛋白和结构蛋白结合，成为介导细胞信号转导的重要位点。作为一种接头蛋白，paxillin能将信号从细胞外经整合素途径向细胞内传递，是细胞骨架与胞外基质连接不可缺少的联系纽带。paxillin可通过重排肌动蛋白的细胞骨架，以及与整合素相互作用来调节细胞的黏附和运动［12］。细胞的运动是细胞因子或趋化因子引导、肌动蛋白的聚合、新的黏着斑不断形成和尾端黏着斑协调性解聚的多步骤的动态过程［13-14］，多项研究表明paxillin可动态调节黏着斑、调节细胞的运动、播散和转移［15-17］，从而提高肿瘤细胞的转移和侵袭能力。本研究中，免疫荧光结果显示 paxillin在GFP-BGC细胞伸出伪足处聚集，而在GFP-PTEN-BGC中未见明显表达。伪足能诱导肌动蛋白重组，形成细胞突起，起到黏附和运动作用［18］。paxillin在伪足聚集，更能促进有伪足形成的癌细胞运动。而此结果也说明PTEN可抑制paxillin的表达，进一步抑制胃癌细胞的转移。

正如本研究发现PTEN可以调节paxillin的表达一样，Herlevsen等［19］也提到PTEN与paxillin有一定的作用关系，但具体通过何种途径作用目前仍不是很清楚。也有研究发现在PTEN的共沉淀物中能检测到paxillin的沉着［20］。PTEN可通过蛋白磷酸酶活性调节FAK的去磷酸化，而paxillin可以作为FAK/Src信号通路的下游信号被磷酸化激活［21］，因此PTEN通过FAK而间接调节paxillin的表达也是有可能的。研究表明PPARγ激动剂能上调PTEN的磷酸化，进而可能导致 FAK和 paxillin的磷酸化［22］。目前将 PTEN、FAK、paxillin三者一起研究的国内外文献甚少，而PTEN调节作为信号传导重要位点的paxillin的表达可能还存在其他的信号转导途径，但其调节机制仍有待进一步研究。

综上所述，本研究采用了免疫印迹及免疫荧光的方法将PTEN及paxillin联合起来研究，证实了PTEN和paxillin都参与了胃癌的发生和发展，同时过表达PTEN和低表达paxillin影响着胃癌细胞的运动和转移，然而有关PTEN对paxillin蛋白表达的调节机制尚不清楚，具体机制有待下一步的继续研究。

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