毛丽梅 王向红 李丽华 李翠芹 王文立 王亚凡

Livin作为凋亡抑制基因，它的异常表达使细胞的正常凋亡机制受损，从而导致有恶变潜能的细胞积累，进而导致肿瘤的发生、发展。Livin含有IAPs家族成员特有的BIR和RING指结构域，它与Caspases蛋白结合，抑制其介导级联激活反应引起细胞凋亡，Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，全部或部分负责大量底物的蛋白水解，抑制Caspase-3的活性或拮抗其功能可使细胞凋亡受抑。由于Livin能够在一些肿瘤中特异性高表达，因此研究其结构和功能为抗肿瘤药物筛选、癌症的治疗有重要意义。目前，笔者见到的国内有关Livin在正常宫颈鳞状上皮、宫颈上皮内瘤变、宫颈鳞癌中的表达情况报道很少，且Livin、Caspase-3和PCNA在宫颈鳞癌癌变发生发展过程中的作用尚不清楚。本研究拟以免疫组化法探讨正常宫颈鳞状上皮、宫颈上皮内瘤变、宫颈鳞癌中Livin、Caspase-3和PCNA的表达情况，以期进一步探讨宫颈鳞癌的发病机制，为宫颈鳞癌的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本采集 选择我院2004至2010年存档蜡块。其中正常宫颈鳞状上皮22例，宫颈上皮内瘤变(CIN)75例，宫颈鳞癌42例(其中高中分化22例、低分化20例;年龄＜50岁29例，≥50岁13例;肿瘤直径≥3 cm者18例，＜3 cm者24例;临床分期:Ⅰa～Ⅰb期30例，Ⅰa～Ⅱb期12例;有淋巴结转移者8例，无淋巴结转移者34例)。

1.2 方法 由2位有经验的病理医师对全部病例的所有切片进行复查。CIN分级按WHO肿瘤病理与遗传学分类［1］，组织学分级(按Broder的宫颈癌分类标准分级［2］)、临床分期(按1995年FIGO分期［3］)的标准进行诊断。采用免疫组化法，一抗为鼠抗人Livin单克隆抗体(美国Imgenex公司生产)，工作浓度均为1∶150。实验步骤按试剂盒说明书进行。将已知的乳腺癌切片作为阳性对照，阴性对照以PBS替代一抗。

1.3 结果判定 按照半定量积分方法，每例均随机观察5个高倍视野(×400)，进行半定量积分判断结果:阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为 3分，＞75%为4分;阳性强度黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将细胞阳性率与染色强度两者积分相乘:0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.4 统计学分析 应用SPSS 15.0统计软件，计数资料采用χ2检验及相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

Livin在子宫颈鳞状细胞癌中的表达与肿瘤分化程度密切相关，高、中分化鳞癌组织Livin阳性表达率明显低于低分化鳞状细胞癌(χ2=6.453，P＜0.05)。Livin的表达与淋巴转移有关，有淋巴转移的宫颈鳞状细胞癌的Livin的阳性表达率明显高于无淋巴转移(χ2=3.953，P＜0.05)。而与年龄、肿瘤大小、临床分期无相关关系(P＞0.05)。Caspase-3在宫颈鳞状细胞癌中的表达与肿瘤分化程度密切相关，高中分化鳞癌组织Livin阳性表达率明显高于低分化鳞状细胞癌(χ2=7.832，P＜0.05)。而与年龄、肿瘤大小、临床分期及淋巴转移无相关关系(P＞0.05)。PCNA在宫颈鳞状细胞癌组和CIN组PCNA的阳性表达明显高于正常组，但其表达与年龄、肿瘤大小、分化程度、临床分期及淋巴转移均无关(P＞0.05)。见表1。

表1 Livin、Caspase-3和PCNA在宫颈鳞癌中的表达及与临床病理参数的关系 例

3 讨论

凋亡抑制蛋白是一类内源性细胞凋亡抑制因子，在很多物种中起着抑制凋亡的作用，其过度表达引起细胞凋亡不足与肿瘤的发生发展密切相关。Livin基因是一种新发现的IAP成员［4］，基因位于人染色体20 q13.3，全长4.6 kb，包含7个外显子及6个内含子，其基因转录产物有2种mRNA亚型，分别编码298个氨基酸蛋白质(α)和280个氨基酸蛋白质(β)，Livin蛋白N端仅包含一个BIR结构，C端含一个RING环指结构。Livin基因只在黑色素瘤、结肠癌、前列腺腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)等肿瘤细胞中及在胎盘、胚胎组织中表达，在多数正常成人组织中不表达。这一表达的特异性使得Livin基因成为目前国际研究的热点［5］。

Livin蛋白主要表达于细胞质［6］。而Ka等［7］对胎盘、滋养层细胞和绒毛膜癌细胞系染色，阳性显色仅定位于胞核。Vucic等［8］研究发现Livin在细胞中主要表达于胞质而不是纺锤体上，但Kasof等［9］认为Livin细胞分布与Survivin相似，即可在胞质和胞核内呈纤维丝状表达，本实验中其阳性显色位于肿瘤细胞的胞质和核内，这与Kasof等［9］结果是一致的。

Livin抑制细胞凋亡作用主要通过其BIR区(位于Livin的86至154氨基酸处)与半胱氨酸蛋白水解酶(Caspases家族)结合，抑制其活性，与Caspases蛋白家族中的多个成员相互作用，尤其是Caspases3/-7和Caspases-9的活性，阻止Caspase蛋白在细胞凋亡时执行蛋白切除功能，达到阻断凋亡受体及以线粒体为基础的凋亡途径而起作用。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，全部或部分负责大量底物的蛋白水解，抑制Caspase-3的活性或拮抗其功能可使细胞凋亡受抑，说明Caspase-3对细胞凋亡是必需的。本实验表明Livin蛋白在正常子宫颈鳞状上皮、CIN和子宫颈鳞状细胞癌3组中表达呈递增趋势，而 Caspase-3蛋白呈递减趋势。这说明 Livin和Caspase-3在宫颈鳞癌发生、发展中的起着重要作用。Livin与Caspase-3的宫颈鳞癌中表达呈负相关(P＜0.05)，这证实Livin可通过对诱发凋亡的效应性蛋白酶Caspase-3有直接抑制作用。在细胞中Livin蛋白将Caspase-3牢固地连接在中心粒上，而使Caspase-3无法发挥蛋白水解的催化功能。凋亡途径因此失去重要的酶，而无法进行凋亡酶依赖的凋亡。

本结果显示，子宫颈鳞状细胞癌中Livin阳性表达率明显高于正常组(P＜0.05)，但正常宫颈组织无Livin蛋白表达。提示Livin可以作为宫颈癌的一种标志物，这不仅有助于宫颈癌的诊断，而且可以为宫颈癌的生物治疗提供依据。另外，Livin表达与肿瘤分化程度密切相关，随宫颈癌分化程度降低，Livin表达率呈增高趋势，有淋巴转移者其阳性表达率高于无淋巴转移，差异有统计学意义(P＜0.05);说明宫颈癌组织恶性分化程度与Livin的表达有关;与PCNA的表达呈正相关(P＜0.05)，进一步从侧面说明了凋亡抑制基因Livin在抑制宫颈癌细胞凋亡及促进增殖中的作用。Livin在一些肿瘤中的特异表达及其功能，为一些恶性肿瘤的检测提供新的分子标志物。亦成为抗肿瘤治疗的新靶点，目前人们已经能够在基因水平上干预基因表达失调所致的疾病，特别以mRNA作为靶标的反义药物，可以减少和消除有害基因的表达，达到治疗疾病的目的。因此，通过直接阻断Livin与目的分子的结合，可以加速肿瘤细胞凋亡，为肿瘤治疗提供新的途径。这些预示着Livin可作为新肿瘤抗原来检测这些肿瘤，并可能成为肿瘤治疗上有前途的分子靶点。然而这些方法目前还仅仅停留在实验阶段，而且大都是体外实验，还有待进一步的临床实验来证实，相信对Livin的进一步研究能够为肿瘤的治疗提供行之有效的新途径。

1 WHO肿瘤病理与遗传学分类，女性生殖器官肿瘤(2003).诊断病理学杂志社，2006.123-125.

2 回允中主译，Stanley J主编.女性生殖道病理学.第1版.北京:北京大学医学出版社，2005.209.

3 刘彤华主编.诊断病理学.第1版.北京:人民卫生出版社，2006. 512.

4 Lin JH，Deng G，Huang Q，et al.KIAP，a navel member of the inhibitor of apoptosis protein family.Biochem Biophys Res Commun，2000，279:820-831.

5 Gzzaniga P，Gradilone A，Giuliani L，et al.Expression and prognostic significance of Livin，Survivin and other apoptosis related genes in the progression of superficial bladder cancer.Ann Oncol，2003，14:85-90.

6 Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al.ML-IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas.Curr Biol，2000，10:1359-1366.

7 Ka H，Hunt JS.Temporal and spatial patterns of expression of inhibitors of apoptosis in human placentas.Am J Pathol，2003，163:413-422.

8 Vucic D，Deshayes K，Ackerly H，et al.SMAC negatively regulates the Antiapoptotic activity ofmelanoma inhibitor of apoptosis(ML-IAP).J Biol Chem，2002，277:12275-12279.

9 Kasof GM，Gomes BC.Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member.J Biol Chem，2001，276:3238-3246.