冯全周，李十中，王莉，李天成

清华大学核能与新能源技术研究院新能源所，北京 100084

在能源短缺和环境污染日益严重的背景下，世界各国都在积极寻求发展可再生能源。生物质能普遍被认为是一种理想的替代能源，特别是燃料乙醇[1-2]。包括农业和工业废弃物在内的木质纤维素是自然界中最为丰富的可再生资源，因此是工业化生产燃料乙醇的理想底物[3-4]。纤维素和半纤维素都是碳水化合物的聚合体，可以被水解为单糖。纤维素水解产物为葡萄糖；而半纤维素水解产物较复杂，主要是以木糖和葡萄糖为主的单糖[5]。所有这些水解产物中，葡萄糖和木糖含量占绝大部分[6-7]。因此，葡萄糖和木糖的高效充分转化是纤维素乙醇生产必须解决的关键问题，引起了国内外的广泛关注。

自然界仅有少数细菌、酵母菌和真菌可发酵木糖产乙醇，但这些天然菌株大多存在乙醇收率低、对水解物中低浓度抑制物敏感、乙醇耐受性低等问题。另一方面，高产乙醇的菌株如酿酒酵母和运动发酵单胞菌等，通常不能利用木糖。为此，人们通过基因工程手段构建出一系列新的重组菌，使其可以发酵木质纤维素水解液中的五碳糖产乙醇[8-13]。但重组菌株发酵速率慢，中间代谢产物木糖醇积累的现象比较严重，无法满足乙醇发酵工业化生产的要求。

运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis乙醇发酵性能优良，与目前乙醇发酵使用的酿酒酵母相比，其高温耐受性好、发酵速度快，有利于节省发酵过程发酵罐冷却能耗，缩短生产周期[14]。此外，Z. mobilis通过ED途径进行糖代谢，是目前已知唯一通过ED途径厌氧代谢的微生物[15]。与酿酒酵母乙醇发酵的EMP不同，ED途径中每分子葡萄糖只产生一分子 ATP，这一低能态造成较低的细胞产量和更高的乙醇产量，提高了乙醇对糖的收率，有利于降低原料消耗。尽管Z. mobilis只能利用葡萄糖、蔗糖和果糖[16],但该种属模式菌株基因组测序已经完成，遗传背景清晰，是通过基因工程操作赋予五碳糖代谢途径的良好出发菌株，已经取得很多研究进展[10-11,17]。

本实验室基于Z. mobilis 31821，将木糖异构酶 (xylA)、木酮糖激酶 (xylB)、转醛醇酶 (talA)和转酮醇酶 (tktA) 基因通过自行构建的质粒结合在一起，构建了一株可以高效利用木糖发酵产乙醇的重组菌株Z. mobilis TSH01。本文研究了该工程菌的最优发酵条件以及对玉米秸秆稀酸水解液的发酵效果，为其应用于利用木质纤维素水解液发酵产乙醇提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒以及引物

大肠杆菌 DH5α被选为质粒表达的受体菌，E. coli K-12提供tktA、talA、xylA以及xylB基因[18],其培养基为LB，培养条件为100 mg/L氨苄青霉素，37 ℃；Z. mobilis ATCC 29191提供Peno和Pgap启动子基因[19-20]；Z. mobilis 31821作为宿主菌接收外源基因代谢木糖产乙醇；质粒pMD-18 Simple T和pBBR322用来合成质粒pMTM (表1)。Z. mobilis培养基为RMG (10 g/L酵母粉、2 g/L的KH2PO4以及各20 g/L的葡萄糖)，30 ℃静置培养。

表1 本实验所用的菌株和质粒Table 1 Strain and plasmid used in this study

1.2 pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA-Peno-xylB质粒的构建

克隆策略如图 1所示，首先，分别以Me-Ori-for和Me-Amp-rev为上、下游引物，从pMD-18 Simple T载体中扩增出氨苄青霉素(Amp) 抗性基因及Ori复制子序列，同时引入几个酶切位点和EZ-Tn5转座酶识别的Me序列；再用引物Tet-for和Tet-rev从pBBR322质粒上扩增出四环素 (Tet) 抗性基因。分别将以上两个PCR产物进行BamHⅠ+NcoⅠ双酶切，DNA纯化后进行连接转化，抗性筛选出正确的克隆质粒pMTM。以Z. mobilis ATCC 29191基因组DNA为模板，Peno-for-NdeⅠ和 Peno-rev-tktA为上、下游引物，扩增得到 NdeⅠ-Peno-3′片段；以E. coli K-12基因组 DNA为模板，tktA-for、tktA-rev-BglⅡ为上、下游引物，扩增得到5′-tktABgl Ⅱ片段。利用前者3′端和后者5′端的重叠序列 (表 2斜体部分) 进行 overlap PCR，得到NdeⅠ-Peno-tktA-BglⅡ操作子，双酶切之后插入质粒pMTM之中，得到质粒pMTM-tktA。相同方法，不同引物 (表 2) 得到另外 3个操作子BamHⅠ-Pgap-talA-BamHⅠ、NdeⅠ-Pgap-xylABamHⅠ和XhoⅠ-Peno-xylB-BamHⅠ。BamHⅠ单酶切 BamHⅠ-Pgap-talA-BamHⅠ之后非定向插入质粒 pMTM-tktA，筛选获得正确的pMTM-talA-tktA质粒。NdeⅠ+BamHⅠ双酶切NdeⅠ-Pgap-xylA- BamHⅠ后定向插入 pMTM-talA-tktA 质粒，筛选到正确的 pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA质粒。最后一个XhoⅠ-Peno-xylBBamHⅠ操作子经 XhoⅠ+BamHⅠ双酶切后定向插入pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA质粒之中，筛选得到最终含有木糖代谢相关的4个基因的质粒：pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA-Peno-xylB。

1.3 重组菌Z. mobilis TSH01的构建

用 ApaⅠ酶切质粒 pMTM-talA-tktA-PgapxylA-Peno-xylB之后，得到两端含有 Me序列的目的基因的片段，将其与转座酶EZ-Tn5混合，室温反应30~60 min，形成转座复合体，取1 μL电转化进入Z. mobilis 31821感受态内，电转化条件参照文献[22]。10 g/L的四环素抗性RMG平板筛选，挑取几个单菌落接种RMGX (20 g/L葡萄糖和20 g/L木糖) 液体培养基中，得到几株可以代谢木糖产乙醇的重组菌，选取其中一株代谢木糖速率最快的进行下步发酵验证，并将其命名为Z. mobilis TSH01。

图1 载体质粒pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA-Peno-xylB的构建Fig. 1 Construction of pMTM-talA-tktA-Pgap-xylA-Peno-xylB.

表2 本实验所用引物Table 2 Primer used in this study

1.4 发酵操作

取出冻存于−80 ℃冰箱内的 Z. mobilis TSH01，用接种环将其接种于50 mL RMGX培养基中，30 ℃静置培养1~2 d至OD600为2~3之间，作为一级种子液；取1 mL一级种子液接种于含200 mL培养基的500 mL三角瓶内，30 ℃厌氧静置培养18 h至OD600约为2，可作为二级种子液。所有发酵实验均采用二级接种，将200 mL二级种子液在4 000 r/min条件下离心5 min，弃上清液，加50 mL灭菌水使菌体重新悬浮，接种于2 L的发酵罐进行发酵。发酵条件为：120 r/min搅拌，不通空气进行厌氧发酵，采用 2 mol/L的KOH溶液调节发酵液的pH。

玉米秸秆水解条件：玉米秸秆粉碎后与2%稀硫酸混合，固液比1∶10，121 ℃保温1 h，过滤，采用CaO过量中和，过滤，调pH至中性，利用真空旋转蒸发仪浓缩备用。

1.5 分析

发酵液中的乙醇含量用气相色谱进行定量分析，方法采用内标法，内标物为正丙醇；葡萄糖、木糖、乙酸、甲酸、糠醛用高效液相色谱进行定量分析，色谱柱使用 Aminex HPX-87H column (Bio-Rad USA) 离子交换柱，流动相为0.05 mol/L的H2SO4，流速为0.6 mL/min，柱温为40 ℃，采用示差折光检测器RID-20A (岛津公司)，检测器温度为40 ℃。

计算公式：

2 结果与分析

2.1 发酵条件的确定

为确定Z. mobilis TSH01的最佳发酵条件，选取40 g/L的葡萄糖和40 g/L的木糖为发酵培养基的碳源，设计两因子、两水平的正交试验，研究温度 (30 ℃和37 ℃) 和pH值 (5和6) 对发酵结果的影响。表3为发酵验证结果，较高pH条件下发酵有更高的葡萄糖利用率，而且据报道[22]，当胞内pH降低时，会导致胞内有机酸处于未电离状态，未电离状态的有机酸会对发酵产生抑制作用；而且相同温度下，当pH为6时，无论是木糖利用率还是乙醇收率均比pH 5时要高；当pH同为6时，37 ℃发酵的木糖利用率和乙醇收率也比30 ℃发酵时要高。37 ℃条件下，控制pH为6的发酵具有最大的木糖利用率和乙醇收率，分别为98.5%和94.3%。为得到更高的乙醇收率，因此37 ℃，pH 6被选定为后续发酵条件。

2.2 纯糖发酵研究

图2为发酵培养基中可发酵糖分别为8%葡萄糖、8%木糖、8%葡萄糖和8%木糖时，糖利用以及乙醇生成随时间的变化趋势。该图表明，单一糖组分发酵时，葡萄糖的完全利用时间为25 h，利用速率为3.06g/(L·h) (5~14 h为快速利用期，利用速率为 6.8 g/(L·h))；而木糖需要发酵72 h才能利用完毕 (无快速利用期)，利用速率为1.01 g/(L·h)。混合发酵时，葡萄糖完全利用需要48 h，利用速率为1.41 g/(L·h) (16~36 h为快速利用期，利用速率为2.55 g/(L·h))；木糖发酵72 h后利用完毕，利用速率为1.05 g/(L·h) (32~48 h为快速利用期，利用速率为 2.54 g/(L·h))。单一糖组分发酵时，虽然二者均可以被充分利用，但是Z. mobilis TSH01对木糖的利用速率要明显低于葡萄糖的利用速率；混合发酵时，由于木糖代谢会产生木糖醇，而木糖醇的存在会抑制菌体生长，从而导致葡萄糖的利用速率降低[23]，在Z. mobilis中，木糖是经由运输葡萄糖的通道Glf进入细胞内的，当葡萄糖存在时会抑制木糖的吸收，而当葡萄糖下降到低浓度时会减少对木糖转运的抑制，木糖便借助Glf通道以较快速度进入胞内进行代谢[21]。

表3 不同温度和pH下Z. mobilis TSH01发酵产乙醇的结果Table 3 Fermentationa results for Z. mobilis TSH01 at different temperature and pH

图2 不同糖源溶液发酵过程中糖源消耗以及乙醇生成动力学曲线Fig. 2 Fermentation of pure sugar. (A) Fermentation of 8% glucose. (B) Fermentation of 8% xylose. (C) Cofermentation of 8% glucose and 8% xylose.

表4计算并比较了3批发酵的糖利用率和乙醇收率。无论是单一组分发酵，还是混合发酵，糖利用率相差不大；但是单一组分发酵时的乙醇收率要远小于混合发酵的，木糖为唯一组分时尤为明显。这一现象的原因包括以下几方面[23]：1)外源基因导入引起的代谢负担增加；2) 包括木糖醇、乙酸、乳酸、乙偶姻以及二羟基丙酮等副产物的生成；3) 木糖醇的抑制；而混合发酵引起乙醇收率增加的现象之前也有过报道[24]。根据图2和表3数据分析的对比结果可以大体推断：在糖源进入胞内的运转机制上，葡萄糖和木糖存在一定的竞争；而低浓度的葡萄糖会促进木糖的胞内吸收。所以混合发酵则会提高发酵效率，获得更高的乙醇收率。

2.3 玉米秸秆水解液发酵分析

作为生产燃料乙醇工程菌的目标发酵底物，木质纤维素原料的水解液成分复杂，包括一系列的糖分 (主要为葡萄糖和木糖) 和乙酸以及呋喃衍生物等抑制物。本实验室采用工业中玉米秸秆的酸解工艺[25]得到水解液，研究了 Z. mobilis TSH01对玉米秸秆稀酸水解液的发酵效果。所制备玉米秸秆水解液中的成分如表5所示。

2.3.1 水解液发酵结果

将得到的稀酸水解液过滤中和后进行浓缩，补加葡萄糖使其与木糖浓度大体一致，加入10 g/L酵母粉和2 g/L的KH2PO4，高温消毒后作为发酵培养基。发酵结果如图3所示，发酵24 h葡萄糖基本消耗完全；72 h时木糖利用率为92.3%；以72 h为截点，计算出乙醇代谢收率为91.5%。发酵0 h取样，测得乙酸、甲酸和糠醛的浓度分别为10.5 g/L、1.5 g/L和1.1 g/L；此外，随着发酵进行过程上述3种物质浓度均会逐渐减低，前两者的浓度降低与加碱有关系，而后者浓度降低是因为菌体发酵过程中被代谢掉了。对比纯糖发酵实验，普通稀酸水解液中所含的抑制物质对发酵影响不大，因此说明，Z. mobilis TSH01对普通稀酸水解液中的抑制物 (主要为10 g/L的乙酸) 具有良好的耐受性。

表4 Z. mobilis TSH01纯糖发酵产乙醇的结果Table 4 Fermentation results for Z. mobilis TSH01 of pure suger

表5 玉米秸秆稀酸水解液成分Table 5 Components of corn stover hydrolysate

图3 玉米秸秆稀酸水解液发酵Fig. 3 Fermentation of corn stover hydrolysate.

2.3.2 添加成分对发酵的影响

图4 添加成分对玉米秸秆水解液发酵的影响Fig. 4 Effect of corn stover hydrolysate fermentation by additional components. (A) Without yeast extract and KH2PO4. (B) With KH2PO4 but yeast extract.

考虑到成本因素，木质纤维素水解液发酵产乙醇过程应该是添加物质越少越好，实验中除调控pH用KOH之外，外源添加物只有酵母粉和KH2PO4，于是我们通过发酵试验验证这两者对糖利用和乙醇收率的影响 (图4)。A组实验为不添加酵母粉和KH2PO4情况下，给水解液补充葡萄糖至浓度和木糖基本相当，灭菌后调控pH进行发酵。发酵72 h后，葡萄糖和木糖利用率分别为98%和68.4%；乙醇代谢收率为84.1%。B组实验为添加KH2PO4但不添加酵母粉情况下，后续操作发酵和A组实验一样。发酵72 h后，葡萄糖和木糖利用率分别为98%和94.4%；乙醇代谢收率为94.5%。B组实验结果表明，酵母粉对糖利用率和乙醇收率基本上没有任何影响。再结合A组实验结果，可以得出结论：KH2PO4对混合发酵木糖利用率和乙醇收率的提高有明显的促进作用，因为调控pH用的是KOH，发酵液中已经存在K+，所以提升发酵效果的应该是PO43−、HPO42−或者H2PO4−，此结论需要进一步验证。

3 结论

通过加强启动子对木糖代谢产乙醇基因的调控，使每个基因均处于强启动子调控之下，避免单一或者几个蛋白对乙醇代谢途径的限制，构建了一株共发酵葡萄糖和木糖性能良好的基因工程菌Z. mobilis TSH01，可同时高效利用葡萄糖和木糖产乙醇。Z. mobilis TSH01的最优发酵条件为添加0.2% K2HPO4、pH 6.0、37 ℃、厌氧发酵。单一糖溶液发酵时，葡萄糖利用速率很高，可以达到3.06 g/(L·h)，而木糖利用速率相对较低，为1.01 g/(L·h)；当二者共发酵时，葡萄糖利用速率降低，而木糖利用速率有所提高，而且当葡萄糖浓度降低到一定值后木糖出现一个快速消耗阶段，该结果表明，Z. mobilis TSH01代谢产乙醇的途径中，葡萄糖和木糖在转运机制上存在竞争关系，而低浓度的葡萄糖会减少对木糖吸收利用的抑制。当混合糖浓度为16% (1∶1)，葡萄糖和木糖的利用率分别为98.5%和97.4%，乙醇代谢收率高达94.9%。其对玉米秸秆稀酸水解液72 h的发酵结果为：葡萄糖和木糖的利用率分别为100%和92.3%，乙醇代谢收率为91.5%。而且KH2PO4对发酵过程中木糖的利用以及乙醇收率提高有明显的促进作用。

Z. mobilis TSH01对玉米秸秆稀酸水解液中的抑制物具有良好的耐受性，而且发酵产乙醇效率很高；发酵环境为厌氧环境，无需搅拌，可减低纤维素乙醇工业化生产成本，具有很好的工业化应用前景。

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