王双山，王 真，吕艳丽，吴清民

（1.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193；2.安阳工学院生物与食品学院，河南 安阳 455000）

布鲁菌病（简称“布病”）是人和牛、羊、猪等动物共患的传染病，也是国家法定检疫－扑杀被感染家畜的3大疫病（口蹄疫、布鲁菌病和结核病）之一［1］。主要通过消化道、呼吸道、生殖道传播，也可通过损伤的皮肤、黏膜等感染，造成以生殖系统为主的多器官损伤。奶牛感染后，怀孕母牛多数发生流产、早产、死胎，流产后常发生子宫内膜炎、不孕和产奶量减少等。近几年在我国奶牛优势区域布鲁菌病疫情上升尤为突出，在各种奶牛传染病中，布鲁菌病是危害最严重的传染病之一。

为掌握布鲁菌病在奶牛优势区域规模化奶牛场感染情况，为布鲁菌病防控对策提出科学的参考依据，本试验用虎红平板凝集试验、96孔微量凝集试验对两个省不同地区几个规模化奶牛场进行了布鲁菌病感染的血清学调查。

1 材料与方法

1.1 试剂 虎红平板凝集试验抗原、试管凝集试验抗原、阳性血清和阴性血清，购自中国兽医药品监察所，按说明书使用。生理盐水、0.5%石碳酸生理盐水等均由本实验室制备。

1.2 器材 玻璃板、96孔微量板，移液器、离心机、试管、牙签、试管架、恒温箱、冰箱等。

1.3 奶牛血样的采集 2010年4～11月，对未接种布鲁菌病疫苗的规模化奶牛场采集样品2 591份。

1.4 待检血清的准备 从每头奶牛尾静脉或颈静脉采集2～4 m L血液，室温静止，待血清析出，血清析出不好的，5 000 r／min离心5 min后，再取血清置于灭菌的小试管内，4℃冰箱保存备用。

1.5 虎红平板凝集试验 按GB／T18646-2002方法对被检测奶牛做初筛试验。

1.5.1 具体操作 洁净的玻璃板，其上划分成4 cm2的方格。将玻璃板上各标记的受检血清号，然后加相应血清0.03 m L。在受检血清旁滴加抗原0.03 m L。用牙签类小棒搅动血清和抗原使之混合。每次试验应设阴、阳性血清对照。

1.5.2 结果判定 在阴、阳性血清对照成立的条件下，方可对被检血清进行判定。受检血清在4 min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性（＋），无凝集现象，呈均匀粉红色者判为阴性（－）。

1.6 96孔微量凝集试验 对虎红平板凝集试验阳性牛再进行微量凝集试验复检。

1.6.1 操作方法 受检血清的稀释：在96孔微量板上2～6孔用移液器加入0.5%石碳酸生理盐水稀释液50μL，第1孔不加稀释液。取1支小试管标记牛编号后，加入230μL 0.5%石碳酸生理盐水稀释液，然后用移液器吸取被检血清20μL加入稀释液内，并混合均匀。充分混匀后，用移液器在96孔微量板的第1、2孔各加入混合液50μL。第2孔再用移液器将混合液与孔内的稀释液混合均匀。混合方法是用移液器将混合液吸入移液器内，在孔内反复吹打3～4次，混合均匀后，吸取第2孔混合液50μL至第3孔，更换枪头用移液器如前述方法进行第3孔混合。按前述方法将50μL混合液加入第4孔，如此倍比稀释至第6孔，第6孔用移液器吸取混匀液50μL弃去。稀释完毕，从第1孔至第6孔的血清稀释度分别为1∶1.25、1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400。抗原用0.5%石碳酸生理盐水20倍稀释，将20倍稀释的抗原加入已稀释好的各血清孔中，被检血清的最终稀释度则依次为1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800。每次试验均都设阳性血清、阴性血清和抗原对照。即阴性血清对照：阴性血清的稀释和加抗原的方法与受检血清同；阳性血清对照：阳性血清须稀释到原有滴度，加抗原的方法与受检血清同。第7孔抗原对照：1∶20稀释抗原液50μL，再加0.5μL稀释液，观察抗原是否有自凝现象。在96孔微量板上贴上薄膜，在微型振荡器上摇匀，置37℃温箱24 h，取出检查并记录结果。

1.6.2 结果判定 将反应板倾斜成45°角，沉于管底的抗原沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀，表明抗原未被或不完全被血清凝集；如果孔底的抗原铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后抗原不流动，说明抗原被血清抗体所凝集。能使50%抗原凝集的血清的最高稀释倍数，称为该血清凝集效价。

表1 布鲁菌病抗体测定操作术式 （μL）

＋＋＋＋：全部抗原凝集，凝集的抗原铺满管底，无抗原沉积。或虽有抗原沉淀，但反应板倾斜成45°角，沉于管底的抗原不沿着倾斜面向下呈线状流动。

＋＋＋：大部分抗原凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数抗原不凝，在管底中心形成小点。

＋＋：约有半数抗原凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不凝集的抗原在管底中心聚成小圆点。

＋：只有少数抗原凝集，不凝集的抗原在管底中心聚成小圆盘状，凝集的抗原在此小圆盘周围。

－：不凝集，抗原沉于管底，成一圆盘，将反应板倾斜成45°角，沉于管底的抗原沿着倾斜面向下呈线状流动的沉淀。

被检血清1∶100稀释，出现“＋＋”以上凝集现象时，判定为阳性。被检血清1∶50稀释，出现“＋＋”以上凝集现象时，判定为可疑反应。

2 结果

2.1 虎红平板凝集试验结果 用虎红平板凝集对A省4个地区及B省两个地区未免疫布鲁菌病的6个奶牛场2 591份血清进行布鲁菌病抗体检测，结果显示，6个地区的6个规模牛场均受布鲁菌感染，血清阳性共722份，布鲁菌病抗体阳性率在14.1%～46.2%之间，平均阳性率27.9%（表2）。

表2 虎红平板凝集试验结果

2.2 96孔微量凝集试验复检结果 根据动物布鲁菌病诊断技术 GB／T18646-2002部颁标准操作规程，虎红平板凝集试验适用于家畜布鲁菌病初筛试验，试管凝集试验适用于诊断牛种布鲁菌病感染的家畜。对虎红平板凝集试验的检测出的722份阳性血清，进行了微量凝集试验。结果显示，602份血清呈阳性，虎红平板凝集试验与96孔微量凝集试验阳性符合率在80.7%～84.9%之间，平均符合率为83.4%；布鲁菌病抗体阳性率在11.5%～39.3%之间，平均阳性率23.2%（表3）。

表3 平板凝集试验的阳性血清进行试管凝集试验

3 讨论

3.1 流行趋势 本次对两省6个地区部分规模化奶牛场布鲁菌病血清学调查表明，调查的6个奶牛场血清学反应全部阳性，说明布鲁菌病在我国奶牛场普遍存在，且感染率高，平均23.2%，个别牛场高达39.3%。本次调查的这些牛场多数是2008年以后建场的，仅仅几年的时间，达到了很高的感染率，显示布鲁菌病在场内蔓延之快。其原因：（1）奶牛场对布鲁菌病造成的危害认识不足，对防治布鲁菌病的知识和流行状况了解甚少。在跨地区购进奶牛优良品种时不进行检疫和不采取隔离措施，致使购入患有布鲁菌病的奶牛，造成布鲁菌病的流行。（2）布鲁菌病阳性奶牛流产的胎儿、胎衣、羊水是病原菌通过环境感染健康奶牛的重要感染源。母牛流产后未及时发现或发现未能及时清理和消毒，以至于病原菌污染环境导致健康奶牛接触而感染。（3）规模化奶牛场，产房每天都有母牛产犊，布鲁菌病阳性母牛正常分娩时也排出大量病原菌污染产房，造成产房健康奶牛感染。

3.2 公共卫生 布鲁菌病是目前世界上流行最广，危害最大的人兽共患病之一。人通过接触感染动物的分泌物、体液、尸体或食入污染的肉、奶被感染。人类感染布鲁菌病后，常因误诊而转为慢性，导致反复发作长期不愈，影响身体健康。临床表现为发烧、多汗、游走性关节痛、全身乏力等［2］。人及动物发现该病后，除了按照有关法规立即上报当地卫生及兽医部门外，对待奶牛场配种员、兽医及饲养人员等属高危人群，为减少人感染布鲁菌的风险，应对相关人员进行岗前培训，搞好个人防护工作，定期进行体检。

3.3 关于微量凝集的操作方法 自Wright建立试管凝集试验以来，布鲁菌病试管凝集试验一直是各国用作诊断人和动物布鲁菌病的常规血清学诊断方法，我国将其列为动物布鲁菌病诊断的法定正式试验，应用广泛。但是《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB／T18646-2002）规定的方法是根据当时的实验室仪器设备条件所建立的，随着实验仪器设备的不断发展与更新，布鲁菌病试管凝集试验中以前使用的吸管现在已被操作更为方便准确的微量移液器所取代［3］。使用移液器进行操作，可进行多份样品同时操作、节省时间，大大提高了检测和诊断效率，更适合大批量奶牛的布鲁菌病检验。同时节省了抗原、稀释液与血清的用量，有广泛的应用前景。

［1］吴清民.动物布鲁氏菌病防控技术研究对策［J］.兽医导刊，2010（3）：21-23.

［2］王传清，李星.布鲁氏菌病的流行和研究现状及防控策略［J］.中国动物检疫，2009（6）：63-65.

［3］李璐.动物布鲁氏菌病试管凝集试验方法改进的探讨［J］.畜牧兽医科技信息，2011（2）：35.