周玉敏，徐自警

（湖北生态职业技术学院，武汉 430200）

三色堇（ViolatricolorL.），堇菜科堇菜属多年生草本植物，在其杂交制种和不育系繁殖过程中，父本花粉的产量及其质量是确定群体种植比例的主要依据之一［1］。笔者采用I－KI染色法、醋酸洋红染色法TTC染色法、过氧化物酶沉淀法、培养基离体萌发试验法对三色堇进行花粉生活力的测定，以期筛选出最佳测定方法，为三色堇大规模制种和贮藏花粉的生活力鉴定提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 材料的采集和处理

实验用花粉采集于学院苗圃地栽培的三色堇，于2011年2月6日上午8：00采摘已开花尚未散粉的三色堇花供测定用。选了5种花色的品种即：一花三色的品种1、纯黄的品种2、黄紫相间的品种3、花瓣边缘呈波浪状的品种4、重瓣形的品种5。将采集来的材料放入4℃冰箱中预处理2h，取出花药，放入准备好的垫有滤纸的培养皿上，放进恒温干燥箱，温度保持在22～25℃中，让其干燥散粉，以待备用［2］。

1.2 试验方法

1.2.1 I－KI染色法。取准备好的花药，置于载玻片上，滴1小滴I－KI（0.1%）溶液，轻轻挤压花药，涂于载玻片上，盖上盖玻片，迅速在显微镜下观察，有活力的花粉被染成蓝色。

1.2.2 TTC染色法。取准备好的花药适量放在一个小玻璃皿内，加入适量TTC溶液，轻轻挤压花药，使花粉粒散在TTC溶液中，放在25℃恒温箱中15min，然后在显微镜下观察。有活力的花粉被染成红色。

1.2.3 醋酸洋红染色法。取准备好的花药，置于载玻片上，滴1滴醋酸洋红溶液，轻轻挤压花药，置于载玻片上，盖上盖玻片，片刻后在显微镜下观察。有活力的花粉被染色红色。

1.2.4 过氧化物酶沉淀法

首先将以下试剂配好：①0.5%联苯胺；②0.5%a－蔡酚；③0.25%碳酸钠；④0.3%过氧化氢。试验前再将溶液①、②、③各10m L混合成试剂I，溶液④为试剂II，在干洁载玻片上放少量准备的花粉，然后加试剂I、II各1小滴，搅匀后盖上盖玻片。30℃条件下10min后在低倍显微镜下观察。有活力的花粉被染成红色。

1.2.5 培养基萌发试验法

①培养基溶液的配制。将0.8g琼脂放入盛有少量蒸馏水的100m L小烧杯中加热、搅拌至充分溶解后分成多份，再在其中加入蔗糖和硼酸，分别配成A、B两组培养基溶液：A组为蔗糖浓度不变（质量浓度为30mg／L）而硼酸浓度变化（质量浓度分别为0、1.0、1.5、2.0、2.5mg／L）的5种培养基浓度；B组为硼酸浓度不变（质量浓度为2.0mg／L）而蔗糖浓度变化（质量浓度分别为0、10、15、20、25、30mg／L）的6种培养基溶液。

②花粉接种。在超净工作台将配制好的培养基均匀地倒入凹玻片中，使与玻片齐平，待凝固后，用消毒过的头发丝将已准备好的花粉接种到所设定的培养基凹玻片上。标注花粉种类、培养基配方号、采集时间和接种时间，放于20～25℃的恒温箱内。

③镜检和花粉萌发率统计。接种花粉2h后开始观察花粉萌发情况，了解花粉的萌发速度和花粉管的生长情况。以花粉管长度超过1／2花粉直径的为有活力的萌发花粉［3］。

花粉萌发率的计算公式：花粉萌发率（%）＝（萌发花粉粒／总花粉粒数）×100%

1.2.6 综合比较试验。将准备好的花粉分别按照5种方法测定花粉生活力，每处理3个重复，每重复观察10个视野，取平均值计算［4］。

2 结果与分析

2.1 三色堇花粉的染色率和萌发率

2.1.1 几种染色方法对三色堇花粉粒的染色结果。通过显微观察，三色堇花粉粒近长柱形，具5孔沟，两极有近圆形的平面，中部粗糙，外壁光滑。实验结果表明，与培养基萌发试验法相比，I－KI染色法、醋酸洋红染色法、TTC法的效果较差，均不适合三色堇花粉生活力的测定，而过氧化物酶沉淀法的测定结果与培养基萌发法的测定结果十分相近。过氧化物酶沉淀法更为准确，是三色堇花粉生活力测定中最理想的测定方法。

2.1.2 不同浓度的蔗糖对三色堇花粉萌发的影响。蔗糖浓度是影响花粉萌发率的重要因素之一，三色堇品种1的备用花粉在B组培养基上培养24h后，对应于蔗糖质量浓度为0、10、15、20、25、30mg／L的培养基上的萌发率分别为0、8.67%、15.88%、35.04%、19.21%、13.12%。萌发率随着蔗糖质量浓度的变化而变化，当蔗糖质量浓度为20mg／L时，萌发率达到最大值35.04%。

2.1.3 不同浓度的硼酸对三色堇花粉萌发的影响。硼酸浓度对三色堇花粉萌发也有一定的促进作用。三色堇品种1的备用花粉在A组培养基上培养24h后，对应于硼酸质量浓度为0、1.0、1.5、2.0、2.5mg／L的培养基上的萌发率分别为0、15.11%、38.24%、20.10%、11.48%。随着硼酸质量浓度的增加，花粉的萌发率呈现先上升后降的趋势。当硼酸质量浓度为1.5mg／L时，萌发率达最大值38.24%。

2.1.4 五个花色三色堇花粉萌发率的比较。五个花色三色堇备用花粉粒在含质量浓度分别为20mg／L、1.5mg／L的蔗糖和硼酸的琼脂培养基上的萌发情况见表1。从表中看出，5个花色三色堇中，一花三色的品种1的花粉生活力最强，其次是花色为纯黄的品种2，重瓣形的品种5花粉的生活力最差。

表1 三色堇花粉的萌发情况

2.2 低温储藏后三色堇花粉的染色率和萌发率

三色堇花粉在温度为2～5℃，空气湿度为30%～50%的条件下贮藏2～5天后，再次对其进行染色试验和萌发试验。试验结果显示：其染色率与备用花粉没有大的变化，但在含质量浓度分别为20mg／L、1.5mg／L的蔗糖和硼酸的琼脂培养基上的萌发率有明显变化。培养14h后，5个花色三色堇的花粉都有明显的萌发；培养24h后，品种1、品种2、品种3、品种4、品种5五个花色三色堇花粉的萌发率分别为90.5%、84.1%、80，2%、78.5%、80.2%。但是随着贮藏时间的继续延长而花活生活力下降。

3 小结

3.1 在实验所进行的5种试验方法中，I－KI染色法、醋酸洋红染色法和TTC染色法效果不明显，不适用于三色堇花粉生活力的测定，这主要是由于三色堇的花粉壁较厚，染色物质不容易进入造成的。过氧化物酶沉淀法和培养基萌发试验法，表现出对三色堇花粉快速、准确地染色效果，故可认为其是测定三色堇花粉生活力的最佳染色方法。

3.2 蔗糖起着维持花粉与培养基之间渗透平衡的作用，也是花粉萌发的营养物质和能量来源。蔗糖浓度对花粉萌发有明显影响。不同植物花粉萌发的适宜蔗糖浓度有所不同。本次试验发现蔗糖质量浓度为20mg／L时能较好地促进三色堇花粉萌发；硼酸可以促进糖的吸收与代谢，增加氧的吸收，参与果胶的合成，有利于花粉管在生长壁中的建造。本次试验发现硼酸质量浓度为1.5mg／L时对三色堇花粉萌发有较好的促进作用。

3.3 花粉贮藏时，随着贮藏时间的增加，花粉内贮藏物质的消耗增多，酶活性下降，水分逐步流失，花粉的生活力会逐渐下降。因此，花粉的贮藏环境与花粉生活力密切相关，即保存的花粉比新鲜花有更高的离体萌发率。这个发现对于花粉的贮藏具有很大的意义。

［1］ 王孝鹏，孙晓梅.三色堇花粉生活力最佳测定方法的筛选［J］.安微农业科学，2008，36（7）：2756－2769.

［2］ 贾文庆，刘宇.紫薇花粉生活力的测定［J］.陕西农业科学，2007（1）：46－48.

［3］ 张志良.植物生理学实验指导［M］.北京：高等教育出版社，2000：240－242.

［4］ 张亚利，曾宪宝.梅花花粉生活力的测定和比较［J］.湖北农业科学，2005（6）：84－86.