徐艳霞 王相晶 焦晓国 潘慧鹏 王少丽 谢 文 吴青君张友军*

（1 东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150030；2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081）

烟粉虱〔Bemisia tabaci（Gennadius）〕属半翅目粉虱科，可通过取食植物韧皮部汁液，传播植物双生病毒，通过引起植物生理代谢紊乱、分泌蜜露、诱发真菌病害等方式对作物生产造成巨大的经济损失（Inbar & Gerling，2007）。最新的系统发育分析、杂交试验和交配行为观察结果表明，烟粉虱是由至少24 个隐种构成的复合种（栾军波和刘树生，2010；de Barro & Ahmed，2011），由于隐种的命名尚未解决，本试验依旧以近年来文献中采用的生物型代替隐种的名称。烟粉虱不同生物型之间其内共生菌的组成、抗药性、传播植物双生病毒的能力等方面存在很大的差异（Luo et al.，2010；Wang et al.，2010；Chu et al.，2011）。在已知的烟粉虱生物型中，B型和Q 型是目前危害最为严重的两种生物型，前者自20世纪80年代在美国造成危害以来在许多国家均有发现，是国际公认的超级害虫；而后者则是20世纪90年代在伊比利亚半岛首先发现，近年来在世界各地迅速扩散成为新的致害生物型（Guirao et al.，1997）。目前，发现Q 型和B 型烟粉虱在许多国家或地区同域发生并造成危害，如西班牙东南部地区和以色列等（褚栋 等，2007）。在我国，B 型烟粉虱于20世纪90年代入侵（罗晨 等，2002），并且迅速扩散，对我国的作物生产造成了巨大的经济损失。Q 型烟粉虱于2003年在云南发现（褚栋 等，2005），而后逐渐取代B 型烟粉虱成为优势生物型（Pan et al.，2011），但是有关其取代机制尚不清晰，目前备受学术界重视（褚栋 等，2007）。

番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）属于菜豆金黄花叶病毒属，由烟粉虱以可循环持久性的传播方式传播（Brown & Czosnek，2002）。在我国，TYLCV 于2005年在上海首次发现（Wu et al.，2006），随后在浙江、江苏、山东、北京以及河北等地均检测到（Mugiira et al.，2008；孙作文 等，2009；张爱红 等，2010；周涛 等，2010），对番茄生产造成了巨大的经济损失。在植物—病毒—烟粉虱这个互作体系中，一方面，病毒对烟粉虱的生物学特性、生理生化特性等产生影响（Colvin et al.，2006；Jiu et al.，2007；刘剑，2009），并能改变其发育历期及解毒酶等相关生化指标（刘剑，2009；欧阳志刚，2010）；另一方面，病毒的存在可以诱导植物应答而改变植物体内物质，这使得取食病毒侵染的植物的昆虫间接受到影响，从而相应影响到了植食性昆虫的许多特性（李萌，2010）。TYLCV 是否对B 型烟粉虱与Q 型烟粉虱具有影响，这些影响是否能够影响B 型与Q 型烟粉虱的竞争取代，目前尚不清楚。对昆虫而言，卵的大小具有较大可塑性，且与昆虫对环境适应性有极显著关联，直接影响其后代的存活率。在环境胁迫条件下，昆虫一般产生大而少的卵，以增加幼虫存活率；相反，在环境适宜条件下，昆虫一般产生小而多的卵，以利于占有更适宜的生境（Duyck et al.，2006）。如单带弄蝶雌虫可根据寄主植物质量差异调整所产卵的大小（Mizumoto & Nakasuji，2007）。此外，病毒的感染可能对烟粉虱的生物学特性产生影响（欧阳志刚，2010）。本试验比较研究了感染TYLCV的B 型和Q 型烟粉虱以及无毒B 型和Q 型烟粉虱在健康番茄苗上所产卵的长度和宽度的差异，并对感染此病毒的雌虫与无毒雌虫进行体长的比较，旨在探讨B 型和Q 型烟粉虱对TYLCV 的适应性差异，进而探讨TYLCV 在B 型和Q 型烟粉虱竞争取代过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

B 型烟粉虱于2004年采自中国农业科学院蔬菜花卉研究所北圃场甘蓝上，然后在甘蓝上继代饲养；Q 型烟粉虱于2009年采自中蔬大森林花卉市场一品红上，而后在一品红上继代饲养。

本试验开始前，把B 型和Q 型烟粉虱分别转接到健康和感染TYLCV 的番茄苗上隔离饲养，建立了4 个烟粉虱品系，本试验使用时已经饲养了6 代。

1.2 供试植物

健康番茄苗：中杂9 号番茄，为中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室培育的未接触任何农药的无虫苗。

TYLCV 感染番茄苗：菌液制备参见李萌（2010）的方法。取3 片复叶期的番茄幼苗，在茎部、叶柄部韧皮部用1 mL 一次性无菌注射器多点注射侵染性克隆菌液，每株注射0.2 mL。接种植株置于可控温室内，一般注射25 d 后即可观察到发病症状。

1.3 试验方法

将健康番茄苗分别放置于实验室隔离饲养6 代的4 个烟粉虱品系的养虫笼内，饲养条件为相对湿度60%～70%，温度30 ℃。其中包括带毒B 型、Q 型烟粉虱番茄种群和无毒B 型、Q 型烟粉虱番茄种群，各种群数量约2 000 头。每养虫笼放置3 株10～12 片真叶期的健康番茄苗。待4 个品系的烟粉虱在健康番茄苗上产卵24 h 后，清除烟粉虱成虫，每株番茄苗上随机取10片叶，每片叶上随机取10 个卵（发现每片叶上卵的数量均多于10 粒），在Leica 显微镜下用解剖针把卵剥离，依次测量每个卵的长度和宽度。另取带毒B 型、Q 型烟粉虱品系和无毒B 型、Q 型烟粉虱品系各30 头初羽化雌虫，-20 ℃存放20 min，而后在Leica 显微镜下测量其体长。

1.4 PCR 扩增及电泳

利用Shatters 等（2009）设计的B 型、Q 型烟粉虱mtDNA COⅠ基因片段PCR 扩增特异性引物和PCR 热循环程序鉴定B 型、Q 型烟粉虱。Q 型烟粉虱mtDNA COⅠ基因片段PCR 扩增特异性引物分别为5′CTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTT 3′和5′CCTTCCCGCAGAAGAAATT TTGTTC 3′；B 型烟粉虱mtDNA COⅠ基因片段PCR 扩增特异性引物分别为5′CTAGGGTTTATTG TTTGAGGTCATCATATATTC 3′和5′AATATCGACGAGGCATTCCCCCT 3′；TYLCV 基因片段扩增特异性引物分别为 5′CGGAATTCATTATGGCGAAACGTCC 3′和 5′CGGGATCCTGAATGGAACA ATAGATGT 3′。PCR 热循环程序为：95 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35 个循环，最后72 ℃延伸10 min，扩增产物大小为413 bp（Ghanim et al.，2007）。PCR 产物用1.0%琼脂糖（0.5×TBE）电泳检测，Biorad 凝胶成像仪观察，记录结果。

1.5 数据处理

采用SPSS17.0 统计软件中独立样本t检验进行处理间试验数据的差异显著性分析，利用SigmaPlot 软件对所分析数据做柱形图。

图1 B型烟粉虱特异性引物对实验室无毒B型烟粉虱番茄种群的扩增结果

2 结果与分析

2.1 B 型和Q 型烟粉虱特异性引物扩增结果

应用B 型烟粉虱的特异性引物从本实验室饲养的无毒B 型烟粉虱番茄种群中扩增到1条478 bp 大小的mtDNA COⅠ基因片段（图1）；使用Q 型烟粉虱的特异性引物亦从本实验室饲养的无毒Q 型烟粉虱番茄种群中扩增到1条303 bp 大小的mtDNA COⅠ基因片段（图2）。应用B 型烟粉虱的特异性引物无法扩增到无毒Q型烟粉虱的此基因片段，使用Q 型烟粉虱的特异性引物亦无法扩增到无毒B 型烟粉虱的此基因片段。

2.2 TYLCV 特异性引物扩增结果

应用TYLCV 的特异性引物从本实验室饲养的带毒B 型、Q 型烟粉虱番茄种群中扩增到1 条413 bp 大小的TYLCV 基因片段（图3）。

2.3 TYLCV 对B 型、Q 型烟粉虱雌虫体长的影响

带毒B 型与无毒B 型烟粉虱雌虫体长分别为0.876 8 mm 和0.899 9 mm，带毒Q 型与无毒Q 型烟粉虱雌虫体长分别为0.863 1 mm和0.899 2 mm（图4），表明带毒B 型烟粉虱雌虫体长小于无毒B 型烟粉虱（t=1.446，df=33，P=0.158），带毒Q 型烟粉虱雌虫体长小于无毒Q 型烟粉虱（t=1.29，df=34，P=0.206），但均无显著差异。

图2 Q 型烟粉虱特异性引物对实验室无毒Q 型烟粉虱番茄种群的扩增结果

2.4 TYLCV 对B 型烟粉虱卵长和卵宽的影响

通过对带毒和无毒B 型烟粉虱所产卵的长度和宽度进行比较，带毒B 型烟粉虱卵长与卵宽分别为0.178 8 mm 和0.085 0 mm，无毒B型烟粉虱卵长与卵宽分别为 0.172 2 mm 和0.082 8 mm（图5），发现带毒B 型烟粉虱所产卵长显著高于无毒B 型烟粉虱（t=-2.745，df=179，P=0.007），带毒B 型烟粉虱所产卵宽显著高于无毒B 型烟粉虱（t=-2.613，df=179，P=0.01）。

图3 TYLCV特异性引物对实验室带毒B型、Q 型烟粉虱番茄种群的扩增结果

2.5 TYLCV 对Q 型烟粉虱卵长和卵宽的影响

通过对带毒和无毒Q 型烟粉虱所产卵的长度和宽度进行比较，带毒Q 型烟粉虱的卵长与卵宽分别为0.181 9 mm 和0.082 9 mm，无毒Q 型烟粉虱的卵长和卵宽分别为0.188 0 mm 和0.086 3 mm（图6），发现带毒Q 型烟粉虱所产卵的长度显著低于无毒 Q 型烟粉虱（t=3.802，df=240，P＜0.001），带毒Q 型烟粉虱所产卵的宽度显著低于无毒Q 型烟粉虱（t=2.836，df=240，P=0.005）。

图4 带毒和无毒B型、Q 型烟粉虱雌虫体长的比较

图5 带毒和无毒B型烟粉虱卵长和卵宽的比较

图6 带毒和无毒Q 型烟粉虱卵长和卵宽的比较

3 结论与讨论

昆虫在不同自然环境下对所产卵大小表现出明显可塑性，卵的大小直接影响其后代存活率及对环境的适应性（Fox，1994；Mizumoto & Nakasuji，2007）。研究发现，许多因素可以影响植食性昆虫所产卵粒的大小（Landa，1992；Kawecki，1995；Awmack & Leather，2002；Fischer et al.，2004）。目前普遍认为：当昆虫处于幼虫存活率低、低营养供应、高捕食风险的胁迫条件下时，会相应减少在寄主植物上的产卵数量，但会增加卵粒大小来调整产卵行为，这是昆虫适应环境的一种表现（Parker & Begon，1986；Sibly et al.，1988；Kawecki，1995）。温度是影响昆虫产卵的常见外部因素，在非洲蝴蝶适宜的产卵温度范围内，该蝶在低温条件下所产卵粒较高温条件下所产卵粒大（Fischer et al.，2004）。Mizumoto 和Nakasuji（2007）将单带弄蝶的卵按大小（大于0.19 mm 的L 组和小于0.16 mm 的S 组）分成两组，在同等条件下培养发现L 组卵的存活率显著高于S 组，L 组卵的发育历期和蛹期显著低于S 组，且L 组的雌虫繁殖力较高并能产生较大后代。此外，植物的营养状态如：碳水化合物、含氮量、植物次生代谢物质也可能影响植食性昆虫所产卵粒的大小（Awmack & Leather，2002），且寄主植物不同器官在不同季节亦可以影响植食性昆虫所产卵粒的大小（Landa，1992）。根据生活史理论，当后代要经历强烈的资源竞争时，昆虫会产出较大的卵，以增加竞争力（Mizumoto & Nakasuji，2007）。研究表明，象甲雌虫在幼虫或成虫密度较高的环境中会产出较大的卵粒，以提高其适应性（Kawecki，1995）。有些植食性昆虫雌虫依据宿主植物质量不同而产出大小不同的卵，如单带弄蝶会根据寄主植物表面粗糙度的差异而调整所产卵的大小（Mizumoto & Nakasuji，2007）。Skippers（Lepidoptera：Hesperiidae）也会根据宿主特异性和叶片粗糙度产出不同大小的卵（Nakasuji，1987）。

一般说来，昆虫产生大的卵粒，由卵孵化出的幼虫相应也大，卵期也相应短，这样可以增加幼虫的存活率和适应性（Fox，1994；Dukas et al.，2001）。本试验结果发现，带毒B 型烟粉虱在番茄上所产卵的长度和宽度均显著大于无毒B 型烟粉虱，而带毒Q 型烟粉虱在番茄上所产卵的长度和宽度均显著小于无毒Q 型烟粉虱，且TYLCV 对B 型、Q 型烟粉虱雌虫体长并无显著影响。推测可能是TYLCV 感染对B 型和Q 型烟粉虱产卵行为产生不同修饰作用。TYLCV 感染可能对B 型烟粉虱带来负面影响，B 型烟粉虱产生大的卵粒；相反Q 型烟粉虱适应TYLCV 的感染，感染后产生小的卵粒。目前只测定、比较了B 型和Q 型烟粉虱在感染TYLCV 和健康番茄苗上的雌虫体长和卵粒大小，要想阐明TYLCV 在B 型和Q 型烟粉虱竞争取代中的作用，还需比较TYLCV 感染对B 型和Q 型烟粉虱生物学特性的影响及B 型和Q 型烟粉虱在健康和感染TYLCV 的番茄苗上的竞争取代。

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