王斐

（青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042）

基质中木聚糖酶活力测定方法的研究进展

王斐

（青岛科技大学化工学院，山东 青岛 266042）

本文综述了基质中酶的提取方法及活力测定方法，如粘度法、生色底物法、琼脂糖扩散法、酶联吸附分析法和目前使用较多的还原糖法，如DNS法和最新涌现的用于微量测定的MBTH法。并就还原端基法介绍了其具体实验手段，如试管法、罐法、微孔板法。分析了方法中存在的问题并展望了该方法研究的发展趋势，如安培法和等温滴定量热法等。

木聚糖酶；测定；DNS法；MBTH法；微孔板法

在木聚糖酶的生产、销售、应用等流通链中，酶活力是质量控制的重要技术指标，而其测定方法则是决定结果是否准确的关键。根据木聚糖酶的来源及应用，所存在的基质包括微生物发酵液、饲料、食品添加剂、纸浆等。基质中酶活力受多种因素影响，如温度、pH、激活剂、抑制剂等[1]。另外，为提高酶制剂的稳定性，无活性载体常被用来将酶进行吸附固定，在检测时如何将酶提取出来也较为关键。其测定方法可按原理不同分为粘度法、琼脂糖扩散法、生色底物法、酶联吸附分析法和目前使用较多的还原糖法等。

1 基质中酶的提取方法的研究

酶的提取质量受提取溶剂、温度、提取时间的影响。同一种酶在不同的基质环境中抽提条件也不同。Cosson等[2]在测饲料中木聚糖酶活力时用pH4.8的柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液在室温下搅拌提取0.5h，离心取上清作为酶提取液。高玲等[3]研究浙江酶、华芬酶、Avizyme-1500三种酶制剂中木聚糖酶的提取，发现华芬酶、Avizyme-150中最佳抽提条件为0.1mol/L的氯化钠溶液4℃抽提12h，而浙江酶是蒸馏水4℃提取12h。苏玉春等[4]采用双水相法从黑曲霉的发酵液中提取木聚糖酶，即选用PEG4000提取体系，其质量分数为19%，磷酸氢二钾质量分数为10%，氯化钠浓度为0，亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相后，酶在两相中分配不同，来达到提纯目的[4]。

2 基质中酶提取液的活力测定方法

2.1 粘度法

该法是通过测木聚糖酶对底物粘度的降解率来衡量酶的活性高低，以阿拉伯木聚糖，水溶性木聚糖衍生物等作为底物[5]。底物粘度可通过测流量的粘度计以及振动旋转粘度计等现代电子设备，引起的电阻变化被转化为酶活力单位。虽然粘度法比较灵敏，但操作复杂繁琐，重复性差，不能测定底物的米氏常数，不常使用。

2.2 琼脂糖扩散法

该法的理论基础是刚果红与多糖的显色反应。将木聚糖和琼脂混合制成凝胶板，在琼脂板上切开一条凿，将酶溶液倒入到凿内与底物在适当条件下发生酶水解，水解一段时间后通过直接测定水解区域的直径来反映酶活力的大小[6]。饲料本身还原糖不与刚果红发生反应，因此有报道将其运用于饲料中木聚糖酶的活力测定。该法操作简单，虽不受饲料本身还原糖的干扰，但培养时间长，对透明圈的分析较为复杂，准确性低于其他非扩散法。

2.3 酶联吸附分析法

该法是将生物素基-木聚糖底物包被在酶标板上，加入木聚糖酶在一定温度条件下酶解后，洗掉已降解的木聚糖，用碱性磷酸酶抗生蛋白链菌素偶联于酶标板上未被降解的生物素基-木聚糖上，然后，加入碱性磷酸酶的底物(对硝基苯磷酸酯)进行显色反应，根据显色的深浅来定量未被降解的木聚糖的量，由此间接地测定木聚糖酶的活力[7]。该法操作简单，成本低，不会因底物中含有过多还原糖而影响测定结果，但是如何针对该方法提取样品(消化道食糜和饲料)中的酶以及如何消除样品中的内源底物的干扰等仍有待于解决。

2.4 底物染色法

该法是对底物进行化学修饰后使其带有特定的荧光物质或染料，在木聚糖酶催化下释放染料或荧光物质，通过释放于乙醇中的染料或荧光物质的多少来反映酶活的大小[8]。可用的染料有雷马氏亮蓝(Retnazolbrilliant Blue R,RBB)、刚果红等，荧光材料有2-(2-苯丙噻唑)酚 (2-(2-benzothiazolyl)-phenyl)、4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferyl)、荧光增白剂(Calcofluor)等。目前文献[9]报道合成一种较好的荧光底物6,8-difluoro-4-methyl-umbelliferyl β-D-xylobioside(DiFMUX2)，找到了内切-β-1,4-木聚糖酶的最佳染色底物为芳基4-硫-β-木糖甘[10]。该类方法操作简单，但由于底物制备的特殊性，提高了测定成本，且该法对温度、离子强度、乙醇浓度及影响染色片段溶解度的因素非常敏感。另外，饲料酶作用的底物是酶的天然底物，不宜采用该法测活力。

2.5 还原糖法

该法是利用木聚糖经酶促水解产生的还原端基被氧化所产生产物的量来计算酶活力，包括DNS法、MBTH法等。

2.5.1 DNS法

该法是利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)在碱性条件下与木聚糖酶解产物的还原末端反应生成橙黄-棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定还原糖的量来表示酶活力[11]。该法是目前最常采用的方法之一，所得产物颜色稳定性好，操作简单，蛋白质对测定无干扰，且测定精密度高。但该法的灵敏度较低，特别是对于Km值较大的酶活力测定情况很难测得酶解初速度，从而不能准确的检测酶含量极低的饲料等基质中的酶活力。

2.5.2 MBTH法

该法同DNS法都属于还原糖法，原理是3-甲基-2-苯并噻唑酮腙MBTH)首先与酶解液中的还原端基反应生成嗪，过量的MBTH被Fe3+氧化成阳离子，再与嗪反应生成青蓝色化合物，在一定范围内，还原端基的量和反应液的颜色强度呈正比，测定波长为630nm或650nm[12]。MBTH法常应用于微量甲醛含量的测定[13]。由于该法灵敏度较高，在木聚糖酶解程度极低的条件下即可测得酶活力，而水解产物中大分子糖链的还原端基不会因分子量的略微变化而有大的反应性改变，即，不同聚合度的同类还原糖，其还原端的显色吸光系数基本相同，因此，所得活力测定数值不会象DNS法那样偏离测定真值[14]。该法已被应用于几丁质酶、溶菌酶的活力测定[15]，其灵敏度比DNS法高十倍以上。

3 还原糖法中木聚糖酶活力的测定手段

尽管某些还原糖法在化学计量方面也存在问题，但由于操作简便且重复性好，因此被广泛用于基质中多糖水解酶的活力测定。而其测定手段又较为多样化，包括试管体系及微孔板法。

3.1 试管法

又称终点法，酶解反应在试管中进行。酶与底物于试管中混合后于恒温水浴锅中进行酶催化反应，反应结束后用终止液终止酶解过程。氧化剂与还原产物进行显色反应后，用分光光度法测定吸光度值。该法适合于在一定时间内酶解速率不变的活力测定，但不能进行动力学分析。

3.2 微孔板法

该法主要是用96孔板在恒温振荡器中进行酶解反应，用酶标仪测定并完成数据的高通量分析。操作过程中最好使用8道式或12道式微量进样器。该法操作简单方便、迅速，试剂用量少，一次可处理大量样品以实现高通量分析，从而降低测定成本，提高测定效率。如Grishutin等[16]将BCA法采用微孔板体系，进行了底物专一性研究。但由于该法对微孔板品质、恒温振荡器的温度均匀性要求较高，因此，其精密度、准确度稍逊于试管法。

4 其它可能用于木聚糖酶活力测定的方法

4.1 安培法

该法是利用酶解产物中还原端基在发生氧化还原反应过程中释放的电子与还原端基的量呈比例关系的特点来测得还原端基的量从而得到酶活力的。如在铁氰化钾安培法中[17]，酶解产生的还原端基在碱性条件下把还原成电化学氧化还原活性物，它能被电极上的正电位氧化为，并释放一个电子，因此可根据氧化电流信号计算还原糖的含量。

4.2 等温滴定量热法

该法适用于Km值较小时的动力学参数测定。其原理是根据酶催化反应时产生的热量与底物降解速率成比例的关系进行酶活力测定的[18]。多糖降解时所产生的热量太小，在活力测定时可加入多糖氧化酶和过氧化氢酶来放大反应焓信号。此法灵敏度高于还原糖法，但由于酶催化水解产生较少的还原端基，而造成后续的多糖氧化酶表现较低活性，因此不能准确测定表观摩尔焓变值。

5 结论

酶是生物活性蛋白质，基质中酶的活力测定还受提取剂、提取温度及提取时间的影响，基质本身也具有能溶于缓冲液的大量杂性物质，也会对酶活力造成一定损失，使测定结果不准确。由于还原糖法操作简单、快捷、便于定量，因此迄今为止仍是木聚糖酶最为常用的活力测定方法，其测定手段多样，可根据测定需要选择不同方法。其中，DNS法在国家标准中使用最多，但灵敏度较低，所测活力值往往偏高。MBTH法的灵敏度较高，因而可测得酶解初速度，受蛋白质干扰极小，定量准确，且特别适合于基质中低酶活力的测定。粘度法和琼脂扩散法虽然操作繁琐、耗时、很难准确定量，但在配料中含有大量还原性物质时，可用于待测样品间的活力比较或用于木聚糖酶高产菌株的筛选。此外，在还原端基法基础上应用安培法可提高测定的灵敏度，等温滴定量热法的灵敏度高于还原糖法中的所有方法，有望应用于含木聚糖酶的动力学及痕量酶活力测定。

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T925+9

A

1008-1267（2012）05-0015-03

2012-04-20