胡嘉波 胡三强 麻全慧 周中卫 王晓慧 张 微

（江苏大学基础医学与医学技术学院，镇江212013； 1江苏省中西医结合医院检验科，南京210028）

人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESC）一般是来自人胚胎囊胚内细胞团的一种全能性干细胞，可以在体外无限传代并保持正常的二倍体核型和多向分化潜能［1－3］。hESC经过诱导可分化成为特定组织细胞，可以潜在用于临床疾病的细胞替代治疗［4－7］。hESC在体外极易分化，必须在培养基中加入分化抑制因子或将其培养在能分泌分化抑制因子的饲养层中［8－9］。小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）分泌多种细胞因子促进hESC的自我更新，并且抑制hESC的分化［10－11］。目前实验室还仍在探索胚胎干细胞的检测方法，细胞化学染色是常用的组织、细胞鉴定方法，除了碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色，其他细胞化学染色技术用于研究hESC的报道较少，我们试建立hESC传代培养方法，观察hESC及其分化过程中的细胞化学染色特性，为进一步研究hESC奠定基础。

材料和方法

1.材 料

1.1 hESC系

SHhES2［12］由中国科学院上海生命科学研究院／上海交通大学医学院健康科学研究所（IHS）金颖博士提供。

1.2 主要试剂

Knockout DMEM、Knockout serum replacement（Knockout SR）、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、重组人碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）为invitrogen公司产品，明胶、β－巯基乙醇、Ⅳ型胶原酶为sigma公司产品，丝裂霉素为Roche公司产品，碱性磷酸酶、过碘酸－雪夫反应（periodic acid-Schiff reaction，PAS）、α－醋酸萘酚酯酶（α-naphthol acetate esterase，α-NAE）、过氧化物酶（peroxidase，POX）染色试剂盒为上海太阳生物技术有限公司产品。

1.3 0.1%明胶

称取0.1g明胶粉末，加入100ml双蒸水配成0.1%的明胶溶液。高压121℃，30min，明胶全部溶解，室温保存。

1.4 1g／L Ⅳ型胶原酶

称取100mgⅣ型胶原酶粉末，溶解到100ml的Knockout DMEM 中，0.22μm滤器过滤除菌。

1.5 丝裂霉素C配制

储存液：2mg丝裂霉素C加10ml PBS，配制成0.2mg／ml的储存液，0.22μm 滤器过滤除菌，锡箔纸包裹，避光，4℃保存。应用液：吸取0.125ml储存液，加 2.375ml Knockout DMEM（内 含 10%FBS），混匀，配成浓度为10mg／L的应用液。

1.6 hESC培养液配制

80%knockout DMEM，20%knockout SR，1 mmol／L L-谷氨酰胺，0.1mmol／Lβ－巯基乙醇，0.1 mmol／L非必需氨基酸，4μg／L bFGF。

1.7 拟胚体培养液配制

不含bFGF的hESC培养液。

2.实 验方法

2.1 hESC饲养层制备

MEF制备见文献［13］，P2-P3代 MEF长到铺满瓶底80%-90%时，弃培养液，加入含10mg／L丝裂霉素C的培养液，在37℃孵箱培养2h后，用PBS荡洗5次，每次2min，0.25%胰蛋白酶消化，800r／min，离心5min。MEF培养液重悬，充池计数，以7×105个细胞／瓶种到0.1%明胶处理的T25培养瓶中，5%CO2，37℃，饱和湿度培养。24h后，弃MEF培养液，加入适量的hESC培养液，放入孵箱，使MEF适应，备用。

2.2 hESC传代培养

传代hESC弃培养液，加入适量1g／LⅣ型胶原酶，置37℃孵箱，镜下观察，见克隆边缘卷曲时，弃胶原酶，加入hESC培养液轻轻吹打，800r／min，离心3min，hESC培养液重悬，用滴管轻轻吹打，将hESC团吹打成适当大小的团块，取出饲养层细胞，弃培养液，将已吹打成小团块的hESC按适当密度接种于已准备好的饲养层细胞上，48h后每日换液，少部分hESC发生自发分化，4-5d传代。

2.3 Giemsa染色

弃hESC培养液，用PBS洗两次，自然晾干，加甲醇固定约1min，晾干，用Giemsa染色液染色15min，水洗待干。

2.4 拟胚体形成

正常传代培养的hESC培养5-6d，加入1g／LⅣ型胶原酶37℃消化，当克隆完全脱壁时，收集细胞团块，用拟胚体培养液重悬，种到细菌培养皿悬浮培养，每2d换液一次。

2.5 细胞化学染色

取状态良好的hESC、自发分化克隆及拟胚体进行 ALP、PAS、α-NAE、POX染色，具体操作按试剂盒说明书进行，所有染色均未复染。

结 果

1.h ESC培养及形态

hESC在MEF上生长状态良好，呈巢状生长，排列紧密，直径300-800μm不等，培养4-5d可传代。hESC单个细胞体积较小，核大，胞质少，核质比高，核仁明显（如图1）。

2.h ESC及自发分化克隆细胞化学染色

典型hESC的 ALP、PAS、α-NAE染色阳性，POX染色阴性；hESC饲养层 MEF的ALP、PAS、α-NAE、POX染色阴性；hESC自发分化后，自发分化克隆边缘分化细胞ALP、PAS、α-NAE染色阳性程度明显减弱，POX染色仍阴性，如图2。

3.拟 胚体形成

hESC悬浮生长后，2d后开始形成拟胚体，拟胚体呈球形，边缘光滑，折光性好，较致密。拟胚体ALP染色弱阳性，PAS、α-NAE染色阳性，POX染色仍阴性，如图3。

讨 论

胰蛋白酶分步消化法制备的MEF，P2～P5之间都可以用作hESC饲养层细胞，能支持hESC的生长并保持hESC未分化的特性［13］。在hESC传代过程中，比较将MEF先用丝裂霉素C处理然后再冻存和冻存新鲜MEF复苏后再用丝裂霉素C处理两种方法对hESC传代的影响，两种MEF保存时间相同，用丝裂霉素C处理后再冻存的MEF状态较差，存活时间相对较短，作为饲养层时，hESC易分化。饲养层MEF密度对hESC的状态有影响，饲养层较密时，hESC贴壁较慢，并且易形成不贴壁的致密团块，hESC生长速度相对较慢；饲养层较稀时，贴壁后的hESC团块厚度薄，易分化，胶原酶消化后易吹散。在传代过程中，培养体系bFGF终浓度为0.4μg／L时，添加bFGF前后对饲养层 MEF形态无明显变化，hESC易分化；bFGF浓度为4μg／L时，饲养层MEF由不加bFGF时的长条形或者不规则形变成细长形，hESC的分化较少（5%以内），说明bFGF可能通过影响饲养层状态而间接影响hESC的生长。在我们的实验条件下，hESC经过30次以上的传代，hESC克隆形态上保持不变。

细胞化学染色是细胞学和化学相结合的一门技术，它以形态学为基础，结合运用化学反应对细胞内的各种化学物质作定性、定位、半定量的分析。常见的细胞化学染色法有ALP、PAS、α-NAE、POX染色等，目前主要用于血液细胞的鉴别，对血液疾病的诊断和鉴别诊断具有重要意义。ALP是一种单脂磷酸水解酶，主要功能是破坏生物氧化过程中有剧毒的过氧化物，使其释放氧，参加细胞内氧化还原过程。ALP高表达与干细胞未分化特性相关，未分化hESC表达丰富，在已分化的hESC中表达减少或消失，ALP染色可作为检测hESC未分化状态的一个重要标志［14］。PAS染色可显示糖原，主要检测组织、细胞内的多糖成分，有报道hESC PAS染色阳性［15］。酯酶是一组具有较大pH范围的水解酶类，按其对不同脂肪酸水解选择性不同，可分为非特异性酯酶和特异性酯酶两大类，α-NAE是一种非特异性酯酶，一般外周血单核细胞含量丰富。POX是外周血中性粒细胞含量最多的一种蛋白质。我们的结果显示：hESC ALP染色阳性，自发分化克隆及形成拟胚体后，阳性程度减弱；hESC PAS、α-NAE染色阳性，自发分化克隆边缘细胞PAS、α-NAE含量明显减低，最边缘甚至呈阴性；hESC POX染色阴性，自发分化克隆及形成拟胚体后仍保持阴性，说明hESC及早期分化阶段POX几乎无活性。

MEF能支持hESC传代培养，hESC细胞化学染色结果，揭示了hESC细胞内的化学组成特征，为鉴别、进一步研究hESC特性奠定了基础。

［1］Thomson JA，Itskovitz Eldor J，Shapiro SS，et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.Science，1998，282（5391）：1145-1147

［2］Reubinoff BE，Pera MF，Fong CY，et al.Embryonic stem cell lines from human blastocysts：somatic differentiation in vitro.Nat Biotechnol，2000，18（4）：399-404

［3］Biswas A，Hutchins R.Embryonic stem cells.Stem Cells Dev，2007，16（2）：213-222

［4］Srivastava AS，Malhotra R，Sharp J，et al.Potentials of ES cell therapy in neuro degenerative diseases.Curr Pharm Des，2008，14（36）：3873-3879

［5］Li Z，Han Z，Wu JC.Transplantation of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for vascular diseases.J Cell Biochem，2009，106（2）：194-199

［6］Doss MX，Sachinidis A，Hescheler J.Human ES cell derived cardiomyocytes for cell replacement therapy：a current update.Chin J Physiol，2008，51（4）：226-229

［7］Best M，Carroll M，Hanley NA，etal.Embryonic stem cells to beta-cells by understanding pancreas development.Mol Cell Endocrinol，2008，288（1-2）：86-94

［8］Amit M，Itskovitz-Eldor J.Derivation and maintenance of human embryonic stem cells.Methods Mol Biol，2006，331：43-53

［9］Richards M，Bongso A.Propagation of human embryonic stem cells on human feeder cells.Methods Mol Biol，2006，331：23-41

［10］Chin AC，Fong WJ，Goh LT，et al.Identification of proteins from feeder conditioned medium that support human embryonic stem cells.J Biotechnol，2007，130（3）：320-328

［11］Eiselleova L，Peterkova I，Neradil J，et al.Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells.Int J Dev Biol，2008，52（4）：353-363

［12］Li CL，Yang YY，Lu XW，et al.Efficient derivation of Chinese human embryonic stem cell lines from frozen embryos.In Vitro Cell Dev Biol-Animal，2010，46（3-4）：186-191

［13］胡嘉波，麻全慧，胡三强，等.人胚胎干细胞饲养层的制备及生物学活性.中国组织工程研究与临床康复，2011，15（23）：4233-4236

［14］Du L，Lin G，Lu G.，et al.Generation and identifica-tion of pluripotent stem cells from human embryonic fibroblast cells by 4defined factors.Zhong Nan Da Xue Xue Bao（Yi Xue Ban），2009，34（12）：1157-1165

［15］Johkura K，Cui L，Asanuma K，et al.Cytochemical and ultrastructural characterization of growing colonies of human embryonic stem cells.J.Anat，2004，205（4）：247-255

图 版 说 明

图1 人胚胎干细胞形态A：倒置相差显微镜（×100）；B：倒置相差显微镜（×200）；C：Giemsa染色（×100）；D Giemsa染色（×200）

图2 人胚胎干细胞及人胚胎干细胞自发分化克隆的细胞化学染色（×100）A、B、C、D：分别为人胚胎干细胞ALP、PAS、α-NAE、POX染色；E、F、G、H：分别为人胚胎干细胞自发分化克隆 ALP、PAS、α-NAE、POX染色

图3 拟胚体细胞化学染色（×100）A：未染色；B：ALP；C：PAS；D：α-NAE；E：POX

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1Morphology of human embryonic stem cells A：inverted phase contrast microscope（×100）；B：inverted phase contrast microscope（×200）；Giemsa stain（×100）；D Giemsa stain（×200）

Fig.2Cytochemical stainning of human embryonic stem cells and spontaneously differentiated colonies of human embryonic stem cells（×100）A、B、C、D：ALP，PAS，α-NAE and POX cytochemical stain for human embryonic stem cells；E、F、G、H：ALP，PAS，α-NAE and POX cytochemical stain for spontaneously differentiated colonies of human embryonic stem cells

Fig.3cytochemical stain for embryoid body（×100）A ：unstained；B：ALP；C：PAS；D：α-NAE；E：POX