金锦莲 张端莲 谈新提

（武汉大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系430071）

大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，在各个国家和地区发病率存在差异，美国和欧洲的发病率较高，亚洲较低［1］。目前大肠癌占全世界癌症发病的第3位，且全球大肠癌发病率仍以2%的速度递增，我国大肠癌发病率近些年以较快的速度增加，尤以大城市为显，引起人们高度重视，在欧美大肠癌死亡率高居恶性肿瘤的第2位，我国年轻人直肠癌发病率较高，且预后较差［2－3］。

大肠癌的发生和发展是肿瘤发生的多阶段过程和多基因改变的典型例子。细胞周期中Gl／S期调控点在细胞恶变的过程中起着很重要的作用，许多癌基因和抑癌基因正是作用于G1／S期调控点而调节细胞的生长和分化［4］。近来研究发现，细胞周期调节失控是肿瘤发生的重要原因，p27和cyclinD1是两种重要细胞周期调节因子，在肿瘤的发生、发展及肿瘤的转移有密切关系［5］。

本研究应用免疫组织化学方法在组织芯片上检测大肠癌组织中p27与cyclinD1表达情况，探讨它们在大肠癌中表达的意义及相互关系，为进一步研究大肠癌发生、发展机制和临床治疗的靶点提供实验依据。

材料和方法

1.材 料

人大肠癌芯片4张由桂林泛谱生物技术有限公司构建，15×10点阵，每点直径1.1mm，4μm厚，其中包括70例大肠癌组织，5例癌旁组织，双芯布阵。所有组织来自临床外科手术切除标本，经10%中性缓冲甲醛固定24h。大肠癌患者中，男40例，女30例，年龄22-76（平均56.8）岁。有淋巴结转移31例，无淋巴结转移39例。所有病例术前均未实施放疗、化疗。兔抗人cyclinD1多克隆抗体、鼠抗人p27多克隆抗体（北京中杉生物技术有限公司），羊抗兔／鼠生物素化二抗。

2.方 法

免疫组织化学法检测大肠癌组织芯片中p27和cyclinD1的表达。

2.1 具体步骤：（1）4μm 组织切片常规脱蜡入水；（2）抗原修复（柠檬酸缓冲液微波抗原修复法）；（3）滴加3%过氧化氢，37℃湿盒孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性；（4）正常羊血清37℃湿盒孵育10min以减少非特异性背景；（5）分别滴加一抗；（6）滴加链霉素抗生物素蛋白－过氧化物复合物37℃湿盒孵育；（7）滴加新鲜配置的DAB显色液显色；（8）苏木素复染；（9）梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片并镜检；（10）用PBS代替一抗作为阴性对照组，购买的阳性片作为p27和cyclinD1的阳性对照组。

2.2 免疫组织化学结果判断

p27和cyclinD1都是以胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应，阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无棕黄色反应物。

2.3 采用美国CRI公司Nuance Fx多光谱成像系统对p27和cyclinD1的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积／单位面积中细胞的总面积×100%）。

3.统 计学处理

量子点染色结果数据以均数±标准差表示，用SPSS 13.0软件对各组反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK（q）检验，检验水准α为0.05。

结 果

1.p 27的表达

大肠癌组织中可见少量的棕黄色颗粒，p27表达弱（图1）；癌旁组织中可见较多的棕黄色颗粒，p27表达强（图2）。图像分析结果见表1。大肠癌组p27的表达明显低于癌旁组织（P＜0.05）。（表1）。

2.c yclinD1的表达

大肠癌组织内可见较多棕黄色颗粒，cyclinD1呈强阳性表达（图3）；癌旁组织核内可见少量的棕黄色颗粒，cyclinD1表达弱（图4）。图像分析结果显示：大肠癌组织的平均光密度和阳性面积率见表2。经q检验，大肠癌组织与癌旁组织之间，cyclinD1的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.05）（表2）。

表2 大肠癌和癌旁组织中cyclinD1表达的平均光密度和阳性面积率（¯x±s）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of cyclinD1 in Colorectal carcinoma and cancer side tissue（¯x±s）

讨 论

大肠癌是最常见的消化系恶性肿瘤之一，虽然临床上对其可采取综合性的治疗措施，但其发病率和死亡率仍居恶性肿瘤的前列，且呈逐年上升的趋势。肿瘤的侵袭、转移仍是大肠癌患者死亡的主要原因。目前临床上尚缺乏有效预测大肠癌转移和早期诊断的方法。

在细胞增殖过程中，细胞周期素（cyclin）、细胞周期依赖性激酶（cyclin2dependent kinase，CDK）和细胞周期依赖性激酶抑制剂（cyclin2dependent kinase inhibitor，CD2KI）起着非常重要的作用。cyclin和CDK起正调控作用，而CDKI起负调控作用［6－7］。

细胞周期素是一些蛋白质在细胞周期中周期性地积累和降解。在人类，周期素有5类，即cyclin-A，cyclin-B，cyclin-C，cyclin-D，cyclin-E，分别参与细胞周期中不同时期的调节。cyclin D1基因又称CCND1、bcl-1或PRAD1，是近年提出的重要的原癌基因，它定位于11q13染色体上，全长15kb，含有5个外显子，4个内含子［8－10］。在人类多种恶性肿瘤中存在扩增、重排及转位等异常，正常细胞周期受到促进和抑制2种相反调控，包括细胞周期素基因的表达、细胞周期素的降解以及CDKS的磷酸化和去磷酸化，两者处于动态平衡［11］。如果由于各种因素使平衡被打破，无论是促进细胞增殖的信号增强，或者是抑制细胞增殖的信号减弱到某种程度，细胞增殖都会失控，进而出现肿瘤［12］。

cyclin-D1与肿瘤的关系是近年研究的热点，它是由CCND1基因编码的产物，促进细胞生长与分裂。正常情况下cyclin-D1蛋白在G1期是恒定的或保持在极低水平；异常情况下其过度表达增加其同CDKS的结合，刺激细胞分裂和增殖，形成癌瘤。研究发现，cyclin-D1蛋白的过度表达与多种肿瘤的发生、发展及预后密切相关［13－16］。

细胞周期中有两个关键的控制点，即G1PS期转换和G2PM期转换。严格控制这两个“控制点”的通行，可实现对细胞周期的控制。但如果这两个“控制点”失控，可使本来停止增殖或生理性凋亡的细胞不停地进入细胞周期，造成恶性增生［17－18］。

本实验应用免疫组织化学技术检测人大肠癌组织芯片和5例癌旁组织中p27的表达。并采用多光谱成像系统对免疫组织化学结果进行图像分析。实验结果显示：大肠癌组织中P27呈低表达，癌旁组织中呈高表达。图像分析结果显示。大肠癌组织中的平均光密度和阳性面积率明显低于癌旁组织（P＜0.05）。推测p27基因突变在肿瘤的发生过程中是稀有事件，p27与肿瘤的关系主要体现在其蛋白水平上，表现为p27蛋白的减少或缺失其机制可能为p27高表达抑制CDK的活性，使肿瘤细胞停滞于G1期，抑制细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡；而p27在大肠癌的低表达，加速肿瘤细胞由G1期向S期的转化，促使肿瘤发展。并提示在大肠癌中，p27蛋白表达下降，表明p27蛋白参与大肠癌细胞生长的调节，这种表达模式有利于癌细胞的快速增殖，细胞分裂中产生的异常染色体来不及修复致使异常细胞产生，导致大肠癌的发生、发展。

在我们的试验中还发现大肠癌组织中cyclinD1呈高表达，癌旁组织中cyclinD1呈低表达，图像分析结果显示：大肠癌组织中的平均光密度和阳性面积率明显高于癌旁组织（P＜0.05）。结果表明：CyclinD1蛋白在大肠癌的癌变过程中具有促进细胞过度增殖的作用，并最终导致调节失控和恶性肿瘤的发生；cyclinD1在细胞周期关键限速点G1至S期转换中，通过激活CDK4或CDK6使后者催化一系列关键底物而导致转录因子释放，促进DNA合成而发挥加速细胞增殖的正性调节作用。

肿瘤的发生是一个多因素、多步骤、多阶段、多种癌基因参与的复杂病理过程，在我们的试验中大肠癌组织中p27的低表达与cyclinD1的高表达同时存在，与病变的进展和不良预后有关，多基因异常可提示大肠癌组织中的转移潜能和预后不良，对这两种基因进行监测，可以更好的指导临床治疗。

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图 版 说 明

图1 p27的表达 大肠癌组织中可见少量的棕黄色颗粒，p27表达弱，S-P×400

图2 p27的表达 癌旁组织中可见较多的棕黄色颗粒，p27表达强，S-P×400

图3 cyclinD1的表达 大肠癌组织内可见较多棕黄色颗粒，cyclinD1表达强；S-P×400

图4 cyclinD1的表达 癌旁组织浆内可见少量的棕黄色颗粒，cyclinD1表达弱.S-P×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1p27expression There were few brown particles in Colorectal carcinoma，p27expressed weakly（→）.S-P×400

Fig.2p27expression There were plenty of brown particles in cancer side tissue，p27expressed strongly（→）.S-P×400

Fig.3cyclinD1expression There were plenty of brown particles in Colorectal carcinoma，cyclinD1expressed strongly（→）.S-P×400

Fig.4cyclinD1expression There were few brown particles in cancer side tissue，cyclinD1expressed weakly（→）.S-P×400