许言午 张江虹 张丽娜 韩志芬 金国琴 (上海中医药大学基础医学院，上海 003)

硫化氢对D-半乳糖所致大鼠心肌组织氧化应激和细胞凋亡的影响

许言午 张江虹1张丽娜 韩志芬2金国琴 (上海中医药大学基础医学院，上海 201203)

目的观察硫化氢对D-半乳糖所致大鼠心肌组织氧化应激及细胞凋亡的影响。方法雄性SD大鼠40只，随机分为对照组、D-半乳糖组、硫化氢6.25μmol/kg组(H2S-1)，硫化氢12.5μmol/kg(H2S-2)组，每组10只。D-半乳糖组每日腹腔注射D-半乳糖400 mg·kg-1·d-1，连续60 d;对照组每日腹腔注射等体积生理盐水;硫化氢组处理同D-半乳糖组，同时分别按6.25和12.5μmol/kg腹腔注射硫化氢。采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸(TBA)法检测心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;采用Western印迹检测Bcl-2和Bax蛋白表达水平并测定组织Caspase-3相对活性。结果与对照组相比，D-半乳糖组大鼠心肌组织SOD活性下降、MDA含量升高，Bcl-2蛋白表达下调、Bax蛋白表达上调，Caspase-3相对活性升高;给予硫化氢能显著改善D-半乳糖所致大鼠心肌组织氧化应激水平，减少细胞凋亡。结论硫化氢可通过提高抗氧化能力和减少细胞凋亡缓解D-半乳糖所致心肌组织损伤。

硫化氢;心肌损伤;氧化应激;细胞凋亡;D-半乳糖

硫化氢(H2S)是近年发现的继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三种内源性气体信号分子，在心血管系统发挥着重要的病理、生理作用〔1，2〕。大量的研究表明，H2S可通过抑制心肌细胞凋亡和减少氧化应激而减轻由缺血-再灌注或缺氧引起的急性心肌损伤〔3～5〕。本研究以D-半乳糖亚急性损伤大鼠为模型，观察H2S对亚急性中毒引起的心肌组织氧化应激和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级雄性SD大鼠，2月龄，体重(250±10)g。由上海中医药大学实验动物中心提供〔动物许可证号:SCXK(沪)2007-0005〕。

1.2 试剂 硫氢化钠 (NaHS):Sigma公司;D-半乳糖:国药集团化学试剂有限公司 (Cat.No.63004434);超氧化物歧化酶 (SOD)检测试剂盒、丙二醛 (MDA)测定试剂盒、蛋白定量Bradford试剂盒:南京建成生物工程研究所;Caspase-3活性检测试剂盒:BioVision公司 (Cat.No.K106-100);兔抗大鼠 Bcl-2抗体、Bax抗体:Cell Signalling公司:(Cat.No.2870，Cat.No.2772);兔抗大鼠 β-actin抗体、HRP标记山羊抗兔抗体:Abmart公司 (Cat.No.P30002，Cat.No.M21003);亲水蛋白分离试剂盒:普利莱基因技术有限公司 (Cat.No.P1250);BCA蛋白质定量试剂盒及超敏ECL试剂盒:Pierce公司 (Cat.No.23225)。其他常用试剂均为分析纯:国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器 组织超声破碎仪(美国Misonix公司);酶联免疫测定仪(美国MD公司);蛋白质电泳、半干转印系统(上海天能科技有限公司);G:BOX凝胶分析系统(英国Syngene公司)。

1.4 方法

1.4.1 动物分组、造模与给药 40只大鼠，随机分为4组:对照组、D-半乳 糖组、H2S-1(6.25 μmol/kg)组 和 H2S-2(12.5μmol/kg)组，每组10只。温度18℃ ～22℃，光暗周期12 h∶12 h，群养，5 只/笼，常规喂养饲料，自由饮水。D-半乳糖组每日腹腔注射D-半乳糖400mg·kg-1·d-1，连续60 d;对照组每日腹腔注射等量生理盐水;H2S-1组和H2S-2组处理D-半乳糖组，同时以NaHS为供体溶解于生理盐水，每日分别按6.25μmol/kg和12.5μmol/kg腹腔注射H2S。

1.4.2 组织取材 大鼠腹腔麻醉(10%水合氯醛，400 mg/kg)，腹主动脉取血处死;取下心肌组织，生理盐水洗净，立即测定或分置于Eppendorf管中-70℃保存。

1.4.3 大鼠心肌组织SOD活性、MDA含量检测 取左心室心肌组织，按100 mg/ml生理盐水加入生理盐水。于冰水浴中小弯剪剪碎，超声破碎，使其充分裂解，4℃离心10 min后取上清，BCA法测定蛋白含量。其余操作按试剂盒说明书进行，并对测定结果进行蛋白含量校正。

1.4.4 大鼠心肌组织凋亡检测

1.4.4.1 Western印迹检测大鼠心肌组织Bcl-2和Bax蛋白表达 取左心室心肌组织，按100 mg/ml加入裂解液，裂解操作同1.4.3，后于4℃离心10 min，取上清，BCA法测定蛋白含量。然后进行电泳及Western印迹分析，其中蛋白上样量调整为80 μg，一抗稀释度为 1∶2 000，二抗稀释度为1∶5 000。Western印迹结果采用Genesnap进行图像采集，Image pro6.0分析软件对条带进行密度扫描，得出条带密度值，以β-actin为内参照。

1.4.4.2 大鼠心肌组织Caspase-3相对活性测定 取大鼠左心室心肌组织50 mg，以100 mg/ml加入试剂盒提供的裂解液，制备组织匀浆，4℃离心5 min，取上清，以Bradford法进行蛋白定量。用稀释液调整上清蛋白含量为2 mg/ml，其余按试剂盒说明书进行。以对照组活性为1，计算Caspase-3相对活性。

2 结果

2.1 硫化氢对D-半乳糖处理大鼠心肌组织SOD活性和MDA含量的影响 见表1。

2.2 硫化氢对D-半乳糖诱导的大鼠心肌组织Bcl-2、Bax表达及Caspase-3相对活性的影响 见表2，图1。

表1 硫化氢对D-半乳糖处理大鼠心肌组织SOD活性和MDA含量的影响(±s，n=10)

表1 硫化氢对D-半乳糖处理大鼠心肌组织SOD活性和MDA含量的影响(±s，n=10)

与对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与D-半乳糖组比较:3)P＜0.05，4)P ＜0.01;下表同

组别 SOD活性(U/mg) MDA含量(nmol/mg)对照组 49.8±3.64) 2.14±0.374)H2 S-1组 41.2±3.72)3) 3.28±0.762)3)H2 S-2组 45.1±4.52)4) 2.72±0.361)4)D-半乳糖组 37.1±2.52) 3.85±0.562)

表2 硫化氢对D-半乳糖诱导的大鼠心肌组织Bcl-2、Bax蛋白表达和Caspase-3相对活性的影响(±s，n=10)

表2 硫化氢对D-半乳糖诱导的大鼠心肌组织Bcl-2、Bax蛋白表达和Caspase-3相对活性的影响(±s，n=10)

组别Bcl-2 Bax Caspase-3对照组 1.00±0.004) 1.00±0.004) 1.00±0.274)H2 S-1组 0.65±0.132)3) 1.52±0.132)4) 2.54±0.332)4)H2 S-2组 0.71±0.142)4) 1.18±0.131)4) 1.76±0.292)4)D-半乳糖组 0.37±0.112) 2.12±0.352) 3.04±0.552)

图1 各组Bcl-2、Bax W estern印迹检测

3 讨论

D-半乳糖引起的亚急性中毒模型是目前被广为使用的拟衰老模型。虽然其作用机制尚未完全明确，但根据衰老的代谢学说，D-半乳糖引起的糖代谢紊乱必然会导致心、肝、肾、脑等重要器官代谢异常，最终出现衰老〔6〕。同时，大量的研究显示，D-半乳糖可通过代谢过程中产生的自由基引起氧化应激损伤〔7～9〕和细胞凋亡〔10，11〕。

长期以来，H2S一直被认为是污染环境的毒性气体，是造成大气和水以及某些职业病的主要危害物质之一。超过生理剂量的H2S对活体器官的毒性主要体现在对中枢神经系统以及对呼吸系统的抑制作用。然而，近年研究表明H2S不但在体内可以内源性生成〔12〕，而且在心血管系统发挥着重要的病理生理作用，被确定为继NO和CO之后的第三种内源性气体信号分子〔2〕。大量的研究表明，H2S预处理和后处理可以通过减少氧化应激损伤、抑制心肌细胞凋亡等机制有效减轻缺血-再灌注或缺氧引起的急性心肌损伤〔3～5〕。那么，H2S对亚急性和慢性损伤引起的心肌氧化应激和细胞凋亡的作用如何未见报道。本文结果说明，外源性给予H2S可通过增强SOD活性，降低MDA含量而减轻D-半乳糖所致大鼠心肌组织氧化应激损伤，同时可以通过上调Bcl-2和下调Bax的表达、降低Caspase-3的活性而减轻心肌细胞凋亡，从而发挥其心肌保护作用。然而H2S对上述指标作用的具体通路机制和内源性H2S/CSE系统在心肌组织衰老等慢性变化中的作用和机制还有待进一步研究。

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R285.5

A

1005-9202(2012)16-3471-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.057

上海市自然科学基金(10ZR1430000，09ZR1403600);上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金(szy08007);上海市教育委员会重点学科建设项目(J50301)资助

1 复旦大学放射医学研究所 2 上海中医药大学教学实验中心

许言午(1974-)，男，博士，讲师，主要从事中医药对老年病防治的研究。

〔2011-11-09收稿 2012-01-10修回〕

(编辑 曹梦园)