程金华 (齐齐哈尔医学院附属第三医院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

应用ELISA方法检测老年动脉粥样硬化患者血清抗负电性低密度脂蛋白自身抗体含量

程金华 (齐齐哈尔医学院附属第三医院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

目的 建立一种通过酶联免疫吸附法(ELISA)定量测定动脉粥样硬化患者血清中抗负电性低密度脂蛋白〔LDL(－)〕自身抗体含量的方法。方法 从老年动脉粥样硬化患者血清中纯化得到LDL(－)，吸附到96孔板用于特异性捕获抗LDL(－)自身抗体。对酶联免疫吸附的最低检测限(LOD)、定量限(LOQ)、批内和批间的精密度以及准确度、回收率进行评价。结果 抗LDL(－)-ELISA分析法线性回归方程为y=1.250 4x+3.292 6(R2=0.994)，线性范围在为0.004～0.125 mU/L。批内和批间的精密度和准确度、回收率均符合免疫分析要求。结论 本文建立的ELISA方法可用于老年动脉粥样硬化患者血清内抗LDL(－)自身抗体的定量分析、临床研究和生化调查。

抗负电性LDL(－)自身抗体;ELISA;评价;动脉粥样硬化

多种抗原刺激物与动脉粥样硬化的发病相关，这些刺激大多来自修饰后的自身抗原负电性低密度脂蛋白〔LDL(－)〕是存在于血清中的修饰度较小的一类LDL，具有致炎和致动脉粥样硬化作用。LDL(－)具有免疫原性，并且人血清中存在针对LDL(－)表位的自身抗体〔1〕。LDL(－)通过炎症和免疫机制，使机体生产的抗LDL(－)自身抗体导致动脉粥样硬化的发生〔2〕。本文拟建立一种通过酶联免疫吸附法(ELISA)定量测定老年动脉粥样硬化患者血清中游离抗LDL(－)自身抗体含量的方法。

1 材料与方法

1.1 分离LDL(－) 按照参考文献〔3〕方法分离从35名60～80岁老年动脉粥样硬化患者体内获得的血清样本，得到纯化的LDL(－)，通过5%琼脂糖电泳检测，上样使用10μg LDL(－)和天然LDL，60 V稳压电泳2 h，用0.5%考马斯亮蓝G快速测定试剂盒显色比较。

1.2 ELISA分析方法建立

1.2.1 方法步骤 在50μl 0.05 mol/L碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中溶解LDL(－)配制成1μg/ml溶液，均匀涂布在96孔板(COSTAR，纽约，康宁)底部，4℃保存过夜。然后用含0.05%吐温 20的磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)洗涤 3次(200μl/孔)。用含2%脱脂奶粉(预先加热到100℃)和0.01%的吐温20的PBS缓冲溶液封闭(150μl/孔)，37℃孵育90min。用上述的缓冲溶液再洗涤3次(200μl/孔)。将标准或样本血清用含有1%脱脂奶粉和0.01%吐温20的PBS按照1∶400稀释，加入到96孔板中(50μl/孔)，37℃孵育90 min。用抗人-IgG结合辣根过氧化物酶(Bio-Rad公司，按1∶2 500稀释)的抗体37℃孵育1 h。过氧化物酶的活性用50μl TMB(Sigma公司)检测，37℃孵育10 min。加入0.5 mol/L的硫酸停止反应，用酶标仪(北京普朗公司)测量450 nm处吸光值(A450)。

1.2.2 绘制标准曲线 分别用6个浓度的标准单克隆抗体(0.001，0.008，0.016，0.031，0.063，0.125 mU/L)作为标准液，一式三份，用1.2.1的方法检测A450值，绘制工作标准曲线，带入下列公式:y=a×x+b，其中y是在450 nm处的吸光度，x为log10 LDL(－)浓度，a和b分别为校准斜率和截距。

1.2.3 最低检测限和最低定量限(LOD，LOQ) 将标准样品三倍稀释直到抗体浓度为0.000 2 mU/L，用1.2.1的方法测A450值，用10个样品的平均吸光值和3倍标准偏差表示LOD:LOD=M10B+3SDB，用10个样品的平均吸光值和10倍标准偏差表示LOQ:LOQ=M10B+10SDB。

1.2.4 精密度和准确度 将含抗LDL(－)自身抗体的血清样品稀释成3不同浓度，使其浓度在整个标准曲线范围内(最低定量限附近1个，中心附近1个，标准曲线上边界附近1个)。批内精密度通过对每个浓度样品重复测定10次进行比较。批间精密度通过对上述浓度样品分5 d各重复测定结果进行比较，结果用变异系数(CV%)表示。LOQ附近浓度样品的批内和批间精密度CV%应小于20%，其他浓度应小于15%。准确度通过测定含内标的抗LDL(－)自身抗体的回收率(R%)表示。回收率应在额定浓度80%～120%范围内。

1.2.5 干扰物质 将血清样品分别加入含有不同浓度的潜在干扰剂，如脂类(甘油三酯等)、总胆红素和血红蛋白。分别测定加入上述干扰剂前后的A450值，前后数值大于20%变化的视为干扰物质。

1.3 统计学方法 应用SPSS15.0统计软件进行分析。

2 结果

得到的纯化物用琼脂糖电泳分析结果，LDL(－)迁移率较天然LDL大。抗LDL(－)自身抗体浓度线性回归方程为y=1.250 4x+3.292 6(R2=0.994)，线性范围为 0.004～0.125 mU/L。血清按1∶100，1∶200，1∶400 和 1∶800 稀释均得到较好的线性。见图 1。经统计学处理，LOD、LOQ分别为0.002 8 mU/L和0.003 2 mU/L，准确度用回收率法表示，回收率为96.7%到112.9%。低浓度(0.006 mU/L)批内、批间、可接受CV分别为6.3%、17.1%、20.0%，中浓度(0.061 mU/L)分别为8.4%、10.1%、15.0%，高浓度(0.110 mU/L)分别为7.2%、11.3%、15.0%。抗LDL(－)自身抗体加入量为0.008、0.012、0.024、0.030 nU/L 时回收率(R%)分别为 98.5 ±6.5，96.7±2.2，112.9±1.2，104.3±2.1。干扰物质实验结果显示，抗LDL(－)自身抗体的ELISA分析没有显著干扰物质，添加的脂类物质高达800 mg/dl(以甘油三酯计)、总胆红素高达20 mg/dl和血红蛋白高达250 mg/dl，对结果产生的变化量分别是8.6%、1.2%和11.2%，小于规定的20%。

图1 抗LDL(－)自身抗体ELISA法标准曲线

3 讨论

免疫分析检测法在对疾病常规诊断和监测上发挥重要作用，本研究的目的是发展一种快速、高效、准确的ELISA法分析老年动脉粥样硬化患者血清中的抗LDL(－)自身抗体的浓度。本法利用老年动脉粥样硬化患者体内提取的血清中分离出而非体外修饰的LDL(－)作为抗原，因此纯化抗原是关键的一步。如果抗原在净化过程中存在污染物，在后面的酶联免疫吸附过程中可能会发生交叉反应，这可能丧失特异性。本文中抗LDL(－)-ELISA法使用通过色谱纯化的LDL(－)，从而保证了检测质量。体外修饰的LDL与体内修饰的LDL的表位抗原有多大程度相同尚不清楚。本研究的最大优点是开发了一种特异性检测针对内源性修饰抗LDL(－)自身抗体的酶联免疫吸附分析法。经过方法验证，该方法批内和批间的精密度和回收率符合免疫分析的要求〔5〕，样品血清中存在的血脂、总胆红素和血红蛋白对检测没有严重影响。另外将血清储存在－20℃ ～80℃长达6个月对检测结果无显著影响，但应减少样本的反复冻融。

1 Pedrosa AM，Faine LA，Grosso DM，et al.Electronegative LDL induction of apoptosis in macrophages:involvement of Nrf2〔J〕.Biochim Biophys Acta，2010;1801(4):430-7.

2 Siqueira AA，Osiro K，Hirai AT，etal.Antibodies against charged subfractions of LDLs are associated with disturbed ankle-brachial index and cardiovascular risk factors in a Japanese-Brazili an population with high prevalence of dislipidemias〔J〕.Int JAtheroscler，2007;2(1):68-74.

3 Santo-Faulin-Tdo E，Sena KC，Rodrigues-Telles AE，et al.Validation of a novel ELISA formeasurement of electronegative LDL〔J〕.Clin Chem Lab Med，2008;46(12):1769-75.

4 Findlay JW，Smith WC，Lee JW，et al.Validation of immunoassays for bioanalysis:a pharmaceutical industry perspective〔J〕.JPharm Biomed Anal，2000;21(6):1249-73.

R587

A

1005-9202(2012)16-3444-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.042

程金华(1969-)，女，主管技师，主要从事医学检验免疫研究。

〔2012-05-17收稿 2012-06-10修回〕

(编辑 袁左鸣)