逍遥散对酒精性肝病大鼠过氧化状态的影响

1 材料与方法

1.1 动物及分组选择纯系Wistar健康成年大鼠50只(由中国医科大学动物实验中心提供)，饲养1 w后分别称重，随机分为5组(每组10只，雌雄各半):空白组、模型组、逍遥散低、中、高剂量治疗组。

1.2 药物与试剂逍遥散由当归、白芍、柴胡、茯苓、白术、甘草、薄荷、生姜组成(饮片购自沈阳市鑫贸大药房)，加工成超细粉(平均粒径14.91μm)，用生理盐水分别制成1、2、3 g/ml三种制剂。白酒50°，北京二锅头(北京市京乐坊酒业有限公司)和纯橄榄油(西班牙原装)购自沈阳市大润发超市。AST、ALT、γ-GT、SOD、GSH-Px和MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 实验方法空白组以0.9%生理盐水代替同量酒精每日清晨灌胃;模型组采用 50°白酒(第1 周 8 ～12 g·kg－1·d－1，每周递增2 g/kg，连续递增2 w后不再递增，即第1周8 g·kg－1·d－1，第 2 周 10 g·kg－1·d－1，第 3 周和第 4 周 12 g·kg－1·d－1)、橄榄油(2 g·kg－1·d－1) 的混合液每日清晨灌胃〔2〕;中药各剂量组与模型组同时同样方法造模，并从造模第1天开始每日下午4时灌胃中药制剂一次，低剂量组(等效于体重为70 kg成人的1日用量〔3〕)、中剂量组(2倍于低剂量组)、高剂量组(3倍于低剂量组)分别灌胃逍遥散超细粉低、中、高剂量制剂1ml/100 g体重、2ml/100 g体重、3ml/100 g体重〔3〕。以上5组均连续给药4 w结束。实验期间，正常光照，室温，正常饲料(购自中国医科大学动物实验中心)和自来水饲养，每周一逐只称重，根据体重调整油量、酒量及药量。治疗组末次给药后，各组大鼠均禁食12 h，分别称重后用乙醚麻醉，剪断颈动脉采血，分离血清(3 000 r/min，10 min)，－20℃保存备检测AST、ALT、γ-GT。然后从肝脏上剪下约1 g肝组织，生理盐水中漂洗，置于高速分散器中，用9 ml生理盐水制成10%肝匀浆，3 000 r/min离心15 min，静置取上清液，得肝组织匀浆，分装于5 ml小瓶内，－20℃保存备检测SOD、GSH、MDA。

1.4 观察指标大鼠皮毛、行为、状态、体重及死亡情况。

1.5 测定指标、方法及仪器应用紫外分光光度计(UV-265FW，日本光电工业株式会社)检测血清AST、ALT、γ-GT等生化指标;应用高速分散器(XHF-1，上海金达生化仪器厂)检测肝组织SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

2 结果

2.1 一般情况实验过程中，因灌胃药物或酒精灌入气管而死亡大鼠3只，其余3只因不能耐受酒精而死亡。造模第1周各组大鼠在酒精灌胃后均四肢无力，精神萎靡，行动迟缓，攻击性降低，多数流涎，这些症状于2 h后逐渐缓解，造模2 w后除空白组外其他各组大鼠皮毛光泽度均较差，以模型组最差，体重增长缓慢。

2.2 各组大鼠血清AST、ALT、γ-GT水平比较与空白组比较，模型组大鼠血清AST、ALT、γ-GT水平显著增高(P＜0.05，P＜0.01);逍遥散各剂量组与模型组比较有显著差异(P＜0.05，P ＜0.01)。见表1。

表1 逍遥散对酒精性肝病大鼠血清AST、ALT、γ-GT水平的影响(±s)

与空白组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;与模型组比较:3)P＜0.05，4)P＜0.01

组别 n AST(IU/L) ALT(IU/L) γ-GT(U/L)空白组103.850±15.993 9 32.669±12.709 20.856±2.818 94.186±8.713模型组 10 49.140±11.0632)30.295±9.4461)112.384±16.7131)逍遥散小剂量组 9 39.251±8.2093)22.533±1.4803) 103.623±9.676逍遥散中剂量组 7 32.373±7.3714)21.211±2.8263)92.926±16.4103)逍遥散大剂量组 9 39.007±8.5253)22.603±3.1373)

2.3 各组大鼠肝组织SOD、GSH-Px、MDA水平比较与空白组比较，模型组大鼠肝组织SOD、GSH-Px、MDA水平有显著差异(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001);逍遥散各剂量组与模型组比较有显著差异(P＜0.05，P＜0.001)。见表2。

表2 逍遥散对酒精性肝病大鼠肝组织SOD、GSH-Px、MDA水平的影响(±s)

与空白组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01，3)P＜0.001;与模型组比较:4)P ＜0.05，5)P ＜0.001

组别 n SOD(U/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)9 106.802±12.186 38.933±6.094 8.75±2.061模型组 10 74.508±11.6663)21.058±14.1502)10.467±1.6431)逍遥散大剂量组 9 112.938±5.7875)38.838±18.2884) 9.149±3.016逍遥散中剂量组 7 113.056±7.6425)37.060±11.2474)7.914±2.7454)逍遥散小剂量组 9 106.481±6.8225)21.589±17.172 7.894±2.5754)空白组

3 讨论

目前认为自由基增多是酒精肝形成的一个重要原因，长期过量摄入的酒精性饮品在肝细胞内经氧化作用产生过多的氧化应激产物，如OH－、O－2及HO－等自由基，这些自由基可攻击生物膜中多不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化反应，产生脂质过氧化物，改变生物膜通透性和流动性，进而影响其结构及功能〔4〕。正常肝内存在具有保护性抗氧化反应物质，SOD和还原型谷胱甘肽(GSH)是肝细胞内主要的抗脂质过氧化物质，SOD能有效清除自由基，以保护细胞不受自由基损害。GSH-Px特异催化GSH与过氧化氢反应生成水及氧化型谷胱甘肽(GSSG)，减轻过氧化物对细胞膜损伤，起到保护细胞膜结构和功能完整的作用〔5〕。肝脏是酒精代谢的主要场所，在肝脏中，乙醇脱氢酶使酒精首先代谢成乙醛，随后乙醛脱氢酶将乙醛还原成乙酸〔6〕，酒精代谢所产生的中间产物对肝细胞有严重损害作用〔7，8〕。长期饮酒，使SOD活力下降，不能有效清除自由基，过量摄入的酒精在超过了肝脏对酒精的生理代谢解毒能力的情况下，大量代谢为毒性化学物质乙醛，乙醛能与GSH结合成复合物，迅速降低细胞内GSH浓度，使GSH经GSH-Px催化与过氧化氢反应数量减少，GSH-Px活性下降，机体内源性抗氧化能力减弱，引起脂质过氧化反应〔9〕，肝内自由基及脂质过氧化物进一步堆积，放大了自由基毒性作用，损伤肝细胞，致使AST、ALT、γ-GT 释放入血液，使血清中 AST、ALT、γ-GT 活性升高。肝细胞膜是氧化应激最活跃的部位，因此肝脏是酒精性损伤好发部位〔4〕。MDA是脂质过氧化物分解的终末产物，因此，SOD和GSH-Px活性降低和MDA含量升高可间接地反映肝细胞脂质过氧化损害程度。另外，长期饮酒造成的营养吸收不良也使食物中抗氧化剂吸收减少。故长期饮酒既导致机体内促氧化物质产生明显增多，也使抗氧化物质减少〔4〕，促发氧化应激反应，最终导致肝细胞死亡或凋亡。本结果表明，逍遥散中剂量的抗脂质过氧化效果更好些，其能显著提高SOD和GSHPx活性，降低MDA含量，提示逍遥散能有效抑制氧自由基引起的脂质过氧化反应，减轻其对肝细胞的损伤。

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