姚 瑶，丁从珠，葛卫红**

南京大学医学院附属鼓楼医院1药学部；2风湿免疫科，南京 210008

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种临床常见的以侵犯滑膜关节为主要特征的自身免疫性疾病，其发病机制复杂，病变过程涉及多种细胞[1]。研究表明，破骨细胞的活化是引起类风湿性关节炎骨破坏的关键[2]。来氟米特是一种免疫调节剂，在体内代谢为有活性的物质teriflunomide[3]（图1），临床用于缓解类风湿性关节炎病人炎症[4]。前期研究表明，来氟米特也能够抑制类风湿性关节炎引起的骨破坏。本实验研究来氟米特活性代谢物teriflunomide对人外周血单核细胞向破骨细胞分化的调节作用，从而探讨来氟米特对抗类风湿性关节炎骨破坏的作用机制。

图1 来氟米特及其活性代谢物结构式和生物转化

1 材料与试剂

Teriflunomide（苏州长征-欣凯制药有限公司，纯度为99.7%）；青藤碱标准品（中国药品生物制品检定所，纯度为99.8%）；改良型α-MEM培养液（Thermo公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；淋巴细胞分离液（天津市TBD生物技术发展中心）；重组人源巨噬细胞集落刺激因子 （MCSF）、细胞核因子kB受体活化因子配基（RANKL，Peprotech公司）；TRAP染色试剂盒 （美国Sigma公司）；TRIzol（美国Invitrogen公司）；SYBR Premix试剂盒、引物（大连TaKaRa公司）。

2 方 法

2.1 健康人外周血单个核细胞（PBMC）的制备

安静状态下抽取静脉血用等量磷酸缓冲液（PBS）稀释混匀，将稀释的外周血沿管壁缓慢加至等体积的淋巴细胞分离液上面，保持两者界面清晰。水平离心机以2000 r·min-1常温离心20 min，吸出中间灰白色PBMC层至另一离心管，用10～15 mL PBS洗涤两次，依次以1500、1000 r·min-1转速离心10 min，吸弃上清。……