姚丽，霍红，韩月，刘天一

(哈尔滨医科大学，黑龙江 哈尔滨 150081)

独活是伞形科植物重齿当归的干燥的根，始载于《神农本草经》，被列为上品。具有祛风除湿，通痹止痛的功效。由于各个朝代的药物著作对其记载不同，自古以来独活种类繁多。药材因产地分布、性状差异而形成不同的商品独活，在全国范围内其代用品及来源于其他植物的20多种药材仍被作为独活应用。据2010年版《中国药典》记载，独活正品来源于伞形科植物重齿毛当归的干燥根，目前主产于四川，因此又称“川独活”。因而，全面、系统的鉴定独活的真伪优劣尤为重要。本文应用了生药学鉴定方法细致地对川独活样品进行鉴别，以期为其鉴定及进一步开发利用提供参考依据。

1 仪器与材料

1．1 仪器

打粉机(天津市泰斯特仪器有限公司);分析天平(梅特勒－托利多仪器有限公司);超声机(宁波新芝生物科技股份有限公司);紫外灯(上海嘉鹏科技有限公司);显微镜(上海仪圆光学显微镜厂);高效液相色谱仪(SHIMADZU);色谱柱(SHIMADZU)。

1．2 材料

独活饮片样本(购于哈尔滨市五大药店);蛇床子素(西安天本生物有限公司);水合氯醛(AR，武汉市和昌化工有限公司);甲醇(AR，西陇化工股份有限公司);乙醇(AR，西陇化工股份有限公司);石油醚(AR，天津市富宇精细化工有限公司);乙酸乙酯(AR，天津市富宇精细化工有限公司);冰乙酸(色谱纯，天津市津东天正精细化学试剂厂);甲醇(色谱纯，沈阳市华东试剂厂)。

2 实验方法

2．1 性状鉴别

5个独活饮片样本(购于哈尔滨市五大药店，鉴定人金锐教授，哈尔滨医科大学生药教研室)，目视观察独活样品横切面的性状特征并进行比较。

2．2 显微鉴别

用打磨机分别将五种独活样品打磨成粉末并标号，用牙签取少许粉末置于载玻片，滴2～3滴水合氯醛，用酒精灯加热至沸腾，盖上盖玻片(从一侧轻触载玻片，避免产生气泡)，置于数码显微镜下观察独活的显微特征。

2．3 薄层色谱法

分别取五种独活样品粉末0．1g，加甲醇1ml，超声处理15min，静置，取上清液作为供试品溶液。另取蛇床子素对照品(中国药品生物制品检定所)，加甲醇，分别制成每1ml含0．4mg的溶液，作为对照品溶液。用毛细管分别吸取五种样品及对照品溶液点于同一硅胶GF薄层板上，以石油醚(60℃ ～90℃)－乙酸乙酯(7∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。

2．4 高效液相色谱法

2．4．1 色谱条件

高效液相色谱仪(Waters 600E);色谱柱:Kromasil C18(中国科学院大连化学物理研究所);流动相:甲醇－1%的冰乙酸水溶液(60∶20);检测波长:300nm;柱温:室温;流速:1．0 mL/min。

2．4．2 对照品溶液的制备

取蛇床子素对照品适量，精密称定，加甲醇配成每1ml含30μg的溶液，即得。

2．4．3 供试品溶液的制备

分别取五种样品粉末约0．5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液12．5ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2．4．4 标准曲线及线性关系

精密称取在60℃减压干燥4h的蛇床子素对照品3．50mg，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得(35．0μg/mL)，作为对照品溶液。在已选定的条件下分别精密吸取 2，4，6，8，10μL 进样，按色谱条件测得峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标，蛇床子素进样量为横坐标，进行线性回归。

2．4．5 精密度考察

精密吸取蛇床子素对照品溶液(35．0μg/mL)10μL，重复进样5次，测定峰面积积分值。

2．4．6 重复性试验

取同一批样品，按样品测定法重复测定5次，得平均含量。

2．4．7 回收率试验

取已知含量的独活样品(含量为0．231 6mg/g)6份，每份约1．5g，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入对照品溶液(0．034 89mg/ml)各10ml，再按“1．4．3”项下方法制备供试品溶液，HPLC分析，进样量均为10μl。

2．4．8 样品的测定

测定时分别精密吸取对照品溶液10μl与五种供试品溶液10μl。注入液相色谱仪，按本色谱条件测定，即得。

3 结果

3．1 性状鉴别

质坚硬，断面灰黄白色，形成层环棕色，皮部有棕色油点(油管)，木部黄棕色;根头横断面有大形贿部，亦有油点。香气特异，味苦辛，微麻舌，以条粗壮、油润、香气浓者为佳(结果见图1)。

图1 独活样品

3．2 显微鉴别

独活的横切面:木栓细胞数列，栓内层窄，有少数油室。韧皮部约占根的1/2;油室较多，排成数轮;形成层成环。木质部射线宽1～2列细胞;导管稀少，常单个径向排列。薄壁细胞含淀粉粒。

独活粉末:呈淡黄色或淡棕色。油室多破碎;主要为网纹导管，亦有螺纹导管;木栓细胞无色或棕色，表面呈多角形，壁稍厚，略呈波状弯曲，木化，有的细胞内含棕色物;薄壁细胞类圆形或类方形，细胞间隙明显。淀粉粒较多，细小，单粒类圆形或椭圆形。(结果见图2)

图2 独活显微特征的数码图片及墨线图(1．油室碎片;2．网纹导管;3．螺纹导管;4．木栓细胞;5．薄壁细胞;6．淀粉粒)

3．3 薄层色谱鉴别

在本实验条件下，样品中的蛇床子素与标准品的荧光斑点重心在同一直线上，斑点圆润、清晰无拖尾现象，主斑点与其他斑点分离较好。结果见图3。

图3 独活的薄层鉴别色谱图

3．4 高效液相色谱法

理论塔板数以蛇床子素计算均不低于25 000，色谱峰之间及与相邻峰之间分离度均大于1．5，对称因子均0．95～1．05之间。独活中蛇床子素的线性范围为:29．8 ～182．7μg/mL(r=0．999 8)。平均回收率为98．47%，RSD=1．25%(n=9)。蛇床子素精密度和重复性实验结果，RSD=0．43% 和0．36%。稳定性试验表明，样品溶液成分在24h内稳定性良好(结果见图4)。

按照上述方法对5种样品进样10ul，结果蛇床子素含量见表1。

表1 蛇床子素含量(%)

4 讨论

我国中药资源丰富，种源广泛，现有药材达12 807种，其中植物药11 146种，占其总数的87%［1］。中药作为中医防病治病的物质基础，它的品种和质量是其价值所在。生药鉴定，仅凭手、眼、口、鼻、耳的感觉，观其形，听其声，嗅其气，尝其味等已不足以判断中药的真伪优劣［2］。随着科技发展，中药研究的不断深入，人们对于中药质量的要求越来越高。中药质量评价是中药现代化的关键，没有中药鉴定方法的现代化，就不能保证中药的质量及用药安全。本文所采用的鉴定方法是以2010版《中国药典》为依据，全面系统地对独活药材进行了鉴定及比较。实验结果表明，从性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱法基本可以鉴别出药材的真伪，而药材的优劣需采用高效液相色谱法进行定量检测。

性状鉴别是传统生药鉴别方法，是辨别真伪的第一关。在我国医药学宝库中积累着丰富的鉴别经验，具有简单、易行、迅速的特点。但对于性状相近或是同一科属的中药材的分辨率较低。根圆锥状，褐色，多分枝以及特异香气是独活的主要性状特征，然而其他伞形科植物的形态特征与其相近，难以辨别。显微技术突破了人类的视觉局限，使观察范围得以延伸，可观察植物的内部结构特征。挥发油为多数伞形科植物共有的化学成分，因而镜下必见油室，而木栓细胞、薄壁细胞为镜下观察的主要特征。与墨线图相比，数码显图片更清晰，细致。可作为独活鉴别的结构依据。从目测及镜下观察，基本可以鉴定真伪，但药材的优劣还需要对主要成分进行定性与定量分析，因而本实验采用薄层色谱法进行定性检测。薄层色谱法是2010年版中国药典一部中鉴别中药的最常用方法［2］。本实验严格按照药典提供的条件进行检测，发现样品中的蛇床子素与标准品的荧光斑点重心在同一直线上，斑点圆润、清晰无拖尾现象，主要成分为蛇床子素。为挑选质量最优样本作为后续药效学实验研究，于是采用高效液相色谱法测定蛇床子素的含量。在实验过程中发现，文献报道常使用的流动相为乙腈－水，甲醇－水，甲醇－冰乙酸水溶液等。由于乙腈毒性较大，实验室较少使用，通过比较了甲醇－水与甲醇－冰乙酸水溶液的分离效果之后，发现以甲醇－体积分数为1%的冰乙酸水溶液(60∶20)为流动相分离效果较好［3－5］。独活提取液的成分复杂，粘性较大，容易造成色谱柱的堵塞，本实验将对照品溶液浓度调试为30μg/ml，在330nm处，成功地比较了5个样品中蛇床子素的百分含量差异，并得出样品5中含量最高。上述几种鉴定方法的综合应用可作为鉴定独活药材的标准。

随着现代科技以及相关学科的迅猛发展，生药鉴别也不断涌现出新方法，如毛细管电泳法，紫外－可见分光光度法，红外分光光度法，气相质谱联用鉴定技术，DNA分子鉴定技术，指纹图谱鉴定技术等［6］。单从发展趋势看，中药的质量标准可能形成两个分支，一个是接近于化学药品质量标准的有效成分的定性定量分析，它可能比较适用于处方简单，有效成分与临床治疗的指标比较吻合的品种。另一个是中药制剂“全成分”的色谱图像分析或指纹图谱分析［7］。评价中药质量金标准是安全有效，因此，质量控制不能孤立进行，必须与现代中药药理及临床研究结合，由质量控制标准向与中医疗效评价结合的标准发展。同时，通过生药鉴定，为科研的源头建立良好的开端，筛选出优质药材，提取分离生物学活性成分，进而为临床药理研究提供质量保障，也为我国中医药的发展奠定坚实基础。

［1］丁海，黄泰康，吴春福．中药现代化发展的进程和趋势［J］．中草药，2005，36(1):147 －149．

［2］杨汝峰．中药鉴定学［M］．北京:中国医药科技出版社，1999:1．

［3］国家药典委员会．中华人民共和国药典［S］．2部．北京:化学工业出版社，2004．

［4］刘晓华，孙文基，李涛．HPLC法测定独活中蛇床子素的含量［J］．药物分析杂志，2004，24(2):212 －213．

［5］邢婕，胡晓静，赵春杰．RP－HPLC法测定独活中蛇床子素和异欧前胡素含量［J］．沈阳药科大学学报，2006，23(2):93 －94．

［6］汪秋兰，王文清，马永贵．高效液相色谱法在中药有效成分含量测定中的应用［J］．医药导报，2011，11(3):1474 －1475．

［7］卓菊．鉴定中药的常用方法［J］．黑龙江医药，2009(3):349－350．