洪 亮 陈其御 王 萍 沈 强 (皖南医学院微生物与免疫教研室，安徽 芜湖 24002)

1995年德国科学家Graham Pawelec小组研究发现，T细胞表面与老化关系最密切的抗原分子是CD28分子。到目前为止，人们已经基本公认CD28分子成为免疫老化的重要标志之一，其在人类CD8+T细胞和CD4+T细胞表面随增龄而表达降低的证据可见于最近的一些报道中。CD28分子是表达在人类95%CD4+T细胞表面和50%CD8+T细胞表面的重要信号分子，主要参与T细胞的活化、增殖、分化及发挥免疫应答作用。其中外周血T细胞膜型CD28(mCD28)和血清中可溶性CD28(sCD28)的表达随年龄的改变而不同。那么，益生菌是否通过改变CD28分子的数量和质量来达到抗衰老的目的呢?本文就乳酸杆菌对老龄小鼠T细胞mCD28的表达水平和血清中sCD28的含量进行定量分析，进一步在分子水平探讨乳酸杆菌在抗衰老中的意义和作用，为免疫衰老机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 培养菌株 分别取冻干保存的Ⅱ型嗜酸乳酸杆菌株在MRS肉汤中复苏增菌，并在固体培养基中接种生长，实验时将培养于固体培养基中的菌苔用PBS洗涤三次，并用麦氏比浊法调各乳酸杆菌浓度至1×1010cfu/ml浓度悬液备用。

1.2 选择试验动物 选取老龄KM小鼠(13～15月龄)80只，雌雄各半，饲养于普通环境中。其中每组再各随机分为两组，一组为试验组，另一组为对照组，每组20只。试验组每天每只老鼠腹腔注射乳酸杆菌0.2 ml/只，对照组每天每只老鼠腹腔注射生理盐水0.2 ml/只，连续10 d。

1.3 标本采集 第11天处死小鼠，每只分别收集肝素抗凝及不抗凝的老龄小鼠外周血2 ml，抗凝血经分离获得单个核细胞，间接免疫荧光及流式细胞仪分析老龄小鼠T细胞mCD28的表达水平，ELISA检测血清中sCD28的含量。

1.4 T细胞mCD28表达水平分析 常规淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，取一定量的细胞悬液(约1×106细胞/ml)，先加入CD28单抗温育，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原-抗体-抗抗体复合物，用FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

1.5 血清中sCD28含量测定 选用自制CD28单抗8G8包被酶标检测板，用3%BSA封闭。分别加入不同浓度的rhCD28/Fc融合蛋白(0～64 ng/ml)和待测血清，37℃反应2 h。充分洗涤后，再加入生物素标记的识别另一抗原表位的CD28单抗2D5和HRP标记的链霉亲和素。洗涤后，加入TMB底物室温反应15 min后终止反应，置酶标仪上测定OD。每个浓度做3个复孔。以标准品rhCD28/Fc融合蛋白的浓度为横坐标，相应的OD值为纵坐标绘制标准工作曲线。根据待测样本的OD值换算出相应的sCD28的含量。

1.6 统计学处理 采用SPSS11.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 老龄鼠外周血T细胞mCD28的表达 经间接免疫荧光及流式细胞仪分析，老龄鼠试验组外周血T细胞mCD28的阳性表达率为:雄性(51.64±7.86)、雌性(53.00±5.40);老龄鼠对照组外周血T细胞mCD28的阳性表达率为:雄性(45.56±3.62)、雌性(47.48±2.59)。其中，同一组内雄性和雌性间比较均无显著差异(P＞0.05);雄性试验组和雄性对照组之间比较有差异(P＜0.05);雌性试验组和雌性对照组之间比较有显著差异(P＜0.01)。

2.2 老龄鼠血清中T细胞sCD28的表达 雄性(0.68±0.20)、雌性(0.73±0.22);老龄鼠对照组血清中T细胞sCD28的含量为:雄性(1.36±0.29)、雌性(1.45±0.27)。其中，同一组内雄性和雌性间比较均无显著差异(P＞0.05);同一性别内试验组和对照组之间比较有显著差异(P＜0.01)。

3 讨论

CD28分子最早是在PMA刺激活化的T细胞上发现的，人与小鼠CD28分子的同源性为68%，CD28分子是一种相对分子量为44 kU的同源二聚体糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，可表达在95%CD4+T细胞表面和50%CD8+T细胞上〔1〕。CD28分子由胞外Ig的V样区、穿膜功能区和胞浆功能区组成〔2〕，它即可以膜型形式表达在T细胞表面，也可以可溶形式存在于血液中，研究表明，mCD28在老年人T细胞上的表达呈增龄性减少〔3～5〕，而sCD28的含量在老龄人血清中较年轻人明显升高〔6〕。有试验证实:sCD28重组蛋白能抑制CD3单抗或丝裂原诱导的T细胞活化〔7〕，抑制细胞的增殖、分化及发挥免疫效应，对T细胞的应答产生负调节作用〔6〕。

乳酸杆菌作为一种益生菌，在生物拮抗、抗肿瘤、抗衰老、免疫调节等方面都有一定的作用。本研究中老龄鼠外周血T细胞mCD28的阳性表达率试验组高于对照组，并且老龄鼠血清中T细胞sCD28的含量试验组低于对照组，但同一组内，雄性与雌性小鼠的外周血T细胞mCD28和血清中T细胞sCD28的含量均没有差异。研究表明:乳酸杆菌可影响T细胞增殖、分化和产生细胞因子的功能，乳酸杆菌还可提高T细胞针对有丝分裂原的增殖能力，使T细胞数量增多〔8〕。CD28/CTLA4-B7作为T细胞活化的第二信号在T细胞的免疫应答过程中起到关键的作用。在小鼠模型中，TCR信号与CD28/CTLA4-B7共刺激信号协同能引起多种细胞银子转录和翻译的上调、T细胞增殖等效应，同时证实CD28/CTLA4-B7在自身免疫、肿瘤免疫和移植排斥反应及老化均起重要作用〔1〕。因此，我们有理由推断:乳酸杆菌的细胞免疫调节作用与CD28分子水平密切相关，相信在不久的将来乳酸杆菌的免疫调节机制将会得到进一步的阐述，其作为一种免疫调节剂具有良好的应用前景。

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5 Boucher N，Dufreu-Duchesne T，Vicaut E，et al.CD28 expression in T cells aging and human longevity〔J〕.Exp Gerontol，1998;33(2):267-78.

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7 Maria ST，Thomas LL，Florentine M，et al.Lake of antibody practioner following immunization in old age:association with CD8+CD28－T cell clonal expansions and an imbalance in the prauction of Thl and Th2〔J〕.J Immunol，2002;169(6):5893-901.

8 Lim BK，Mahendran R，Lee YK，et al.Chemopreventive effect of Lactobacillus rhamnosus on growth of a subcutaneously implanted bladder cancer cell line in the mouse〔J〕.Jpn J Cancer Res，2002;93(1):36-41.