纪树武 毛小东 刘菊梅 陈海泉 袁 平 房志鹏 徐 峰

（1 上海市第七人民医院胸外科，上海 200137；2 复旦大学附属肿瘤医院胸外科，上海 200032；3 美国安德森癌症研究中心，休斯敦77030）

食管癌肿瘤组织血管紧张素转换酶基因多态性

纪树武1毛小东1刘菊梅1陈海泉2袁 平3房志鹏1徐 峰1

（1 上海市第七人民医院胸外科，上海 200137；2 复旦大学附属肿瘤医院胸外科，上海 200032；3 美国安德森癌症研究中心，休斯敦77030）

目的 研究食管癌患者肿瘤组织中血管紧张素转换酶（ACE）基因多态性，探讨该基因与食管癌之间的关系。方法 共检测50例食管癌患者组织标本，利用聚合酶链反应（PCR）检测ACE基因，观察插入型（ID型）、缺失型（DD型）和Ⅱ型3种基因型多态性分布，并计算I/D等位基因的比例，以10例癌旁正常组织为对照。结果 食管癌患者肿瘤组织中ACE基因插入/缺失（I/D）多态性分布特点：ID型、DD型和Ⅱ型基因比例分别为16%，64%，20%，而I/D等位基因分布频率分别为20%和80%，对照组ID型、DD型和Ⅱ型3种基因型的比例分别为40%、30%、30%，其I/D等位基因分布频率分别为30%和70%，两组间DD型基因分布频率有统计学显著性差异（P＜0.05）、I/D等位基因分布频率无显著性差异（P＞0.05）。结论 食管癌患者肿瘤组织中存在ACE基因I/D多态性，DD型基因分布较癌旁正常组织显著升高，结果表明DD基因型高表达可能与食管癌发病相关。

血管紧张素转换酶；基因；多态性；食管癌

食管癌是危害人类健康的常见消化道恶性肿瘤之一，且发病率有逐年上升趋势[1]。血管紧张素转换酶（angiotensin Ⅰ-converting enzyme，ACE）与消化道肿瘤存在一定关系[2]。胡艳等研究发现，结肠癌患者ACE基因中的II型基因高表达可能与结肠癌发病存在一定相关[3]。但迄今，有关ACE基因与食管癌发病之间的关系尚不明确，为此，我们开展了本研究，通过检测50例食管癌患者切除的肿瘤组织中ACE基因多态性，以了解该基因ID型、DD型和Ⅱ型3种基因型在食管癌中的分布频率，以该组病例部分癌旁正常组织作为对照，探讨ACE基因插入（insertion，I） /缺失（deletion，D）多态性与食管癌发病之间的关系，现将我们的研究报道如下。

1 材料与方法

1.1 入选病例

选取本院2008年1月至2010年6月住院食管癌患者50例。入选标准：①临床确诊食管癌患者；②全部病例均取得病理报告证实；③年龄20～70周岁；Karnofsky评分＞70分； 排除标准：①不符合食管癌诊断标准者；②未取得病理报告证实者；③年龄不符者；④原发性高血压病患者；⑤不愿意接受本研究措施者。

1.2 患者情况

研究组共50例，年龄40～70周岁，其中男性27例，女性23例，平均年龄62.9±9.8岁，临床分期Ⅰ-Ⅱ期者19例，Ⅲ-Ⅳ期者31例，从研究组中随机抽取10例癌旁正常组织作为对照，经统计学处理，两组在年龄、性别、家族史、吸烟史等方面均无显著差异（P＞0.05）。

1.3 DNA提取、引物合成和PCR扩增

采用蛋白酶K消化酚－氯仿抽提法，按参考文献[4]进行。引物由上海生工合成，序列如下：

ACE-1-上游: 5'-GCCCTGCAGGTGTCTGCAGCATGT-3'

ACE-1-下游: 5'-GGATGGCTCTCCCCGCCTTGTCTC-3'

插入型扩增片段大小为597bp，缺失型为319bp。其PCR扩增体系：体积为25µL，反应体系含Taq酶1.0µL，10×buffer 2.5µL，10mmol/L dNTP 0.5µL，引物（10pmol/µL）各0.5µL，模板gDNA约100ng。扩增条件为：94℃预变性5min，然后94℃30S，56℃45s，72℃1min，共35个循环；最后72℃ 5min。试剂购自Takara公司。为保证结果的真实可靠，对于基因型为DD型的标本再用特异性扩增插入片段的ACE-2进行验证，如扩增出目的片段则为ID型。ACE-2引物序列如下所示：

ACE-2-上游：5'-TGGGACCACAGCGCCCGCCACTAC-3'

ACE-2-下游：5'-TCGCCAGCCCTCCCATGCCCATAA-3'

扩增片段大小为335bp，退火温度为65℃，其反应条件同ACE-1。

1.4 PCR产物的鉴定检测

所有PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳约30min，电压100v，在紫外灯下观察条带。所用Marker为DL2000。

1.5 统计学处理

采用SPSS15.0统计软件包，组间频率比较采用χ2检验，以P＜0.05为有显著性差异。

2 结 果

2.1 食管癌患者PCR产物电泳结果，见图1、图2。

图1 食管癌患者ACE-1扩增后产物电泳结果

图2 癌旁正常组织ACE-1扩增后的电泳结果

其中图1为食管癌组织部分电泳结果，1，5，6，9，11号标本为DD型；4，7，8，10，12，13号标本为ID型；2，3，14，15号标本为Ⅱ型。图2为癌旁正常对照组电泳结果，3，5，10号标本为DD型；1，4，6，7号标本为ID型；2，8，9号标本为Ⅱ型。

2.2 食管癌ACE基因型结果分析

DD型在ACE-1扩增后仅有一条319片段条带，有一条579片段条带的则为II型，同时见上述两种条带的则为ID型。ACE-2扩增主要是防止和纠正优势片段扩增，防止结果误判。结果，在50例食管癌患者组织标本中，缺失纯合子型（DD型）有32例，比例为64%（32/50）；有8例标本为缺失杂合子型（ID型），比例为16%（8/50）；插入纯合子型（II型）共10例，比例20%（10/50）；共检测10例癌旁正常组织，测得结果为DD型、ID型、II型分别占30%（3/10）、40%（4/10）和30%（3/10），经统计分析，两组在DD型基因的分布频率上有显著差异（χ2= 3.963，P＜0.05）。见表1，对等位基因进行分析，结果无显著差异（χ2=0.491，P＞0.05），见表2。

表1 食管癌患者肿瘤组织ACE基因多态性检测结果

表2 食管癌患者肿瘤组织ACE等位基因检测结果

3 讨 论

ACE基因位于17号染色体长臂q23位点，由26个外显子和25个内含子组成，其16内含子存在一段287bp的DNA序列的插入（I）或缺失（D），由此构成ACE基因I/D多态性并分出基因型三种：即ID型（缺失与插入纯合子）、DD型（缺失纯合子）、Ⅱ型（插入纯合子）。多年来，ACE基因一直是高血压病和肾病等的热点基因。文献提示ACE抑制剂显著降低结肠癌风险[5]。周莉等研究ACE与结肠癌的关系，发现ACE多态性与结肠癌发病可能相关[6]，而ACE多态性与食管癌关系如何，相关报道较少。

近几年来ACE基因与肿瘤发病关系的研究渐热。Attoub及Herr等的研究发现ACE基因I/D多态性与乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌等肿瘤的发病相关[7-9]。文献报道缺失型片段存在优势扩增，故DD型通常需要用扩增插入片段的特异性引物进行扩增后验证，而我们在实验过程中也确有发现某些ID基因型的样本亦表现为插入片段优势扩增，提示我们在进行相关研究时须注意优势扩增和错配的问题。

在本研究中，共选取了食管癌患者50例，检测肿瘤组织中ACE基因多态性及I/D等位基因，探索其与食管癌发病的关系。结果表明食管癌患者肿瘤组织中ACE基因ID型、DD型及Ⅱ型基因分布频率较癌旁正常组织有显著性差异，其中DD型基因频率显著高于对照（P＜0.05），这与我们从外周血中得到的结果是一致的，说明ACE基因的缺失多态性有可能是食管癌发病的重要遗传因素之一，本研究呼应了Vairaktaris等的研究结果，说明ACE基因与食管癌在内的多种肿瘤相关。

总之，本研究初步证明食管癌发病与ACE基因的多态性分布相关，其中DD基因型高表达可能是食管癌易患因素之一，但本研究的不足之处也是存在的：由于条件限制，所获样本数量较少，所获得的结果尚需更多更加深入的研究加以证实，而这也是我们下一步努力的方向之一。

[1] Li YF,Hu Y,Lin P,et al.Significance of subcarinal lymph node selective dissection in thoracic esophageal carcinoma[J].Chin Med J,2010,90(37):2636-2639.

[2] Rocken C,Rohl FW,Diebler E,et al.The angiotensin II/angiotensin II receptor system correlates with nodal spread in intestinal type gastric cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2007,16(6):1206-1212.

[3] 胡艳,侯安继,张红卫,等.结肠癌患者肿瘤组织中血管紧张素转换酶基因多态性研究[J].肿瘤杂志,2010,30(3):265-266.

[4] Zhao L,Wang,L,Ji W,et al.Association between plasma angiotensinconverting enzyme level and radiation pneumonitis[J].Cytokine,2007,37(1):71-75.

[5] Neo JH,Malcontenti-Wilson C,Muralidharan V,et al.Effect of ACE inhibitors and angiotensin II receptor antagonists in a mouse model of colorectal cancer liver metastases[J].J Gastroenterol Hepatol,2007,22(4):577-584.

[6] 周莉,胡艳,张红卫,等.结肠癌患者外周血血管紧张素转换酶基因多态性[J].肿瘤防治研究,2010,37(9):1040-1043.

[7] Herr D,Rodewald M,Fraser HM,et al.Potential role of Renin-Angiotensin-system for tumor angiogenesis in receptor negative breast cancer[J].Gynecol Oncol,2008,109(3):418-425.

[8] Yaren A,Oztop I,Turgut S,et al.Angiotensin-converting enzyme gene polymorphism is associated with anemia in non small-cell lung cancer[J].Exp Biol Med (Maywood),2008,233(1):32-37.

[9] Sugimoto M,Furuta T,Shirai N,et al.Influences of chymase and angiotensin I-converting enzyme gene polymorphisms on gastric cancer risks in Japan[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2006,15(10):1929-1934.

The Polymorphism of Angiotensin Ⅰ-converting Enzyme Gene in Tumor Tissue of Esophageal Carcinoma Patients

JI Shu-wu1, MAO Xiaod-ong1, LIU Ju-mei1, CHEN Hai-quan2, YUAN Ping3, FANG Zhi-peng1, XU Feng1
(1 Department of Thoracic Surgery, Shanghai Seventh People’s Hospital, Shanghai 200137, China;2 Department of Thoracic Surgery, Fudan University Affliated Cancer Hospital, Shanghai 200032, China;3 United States Anderson Cancer Center，Houston 77030，USA)

ObjectiveThe present study was assigned to investigate the correlation between the insertion/deletion (I/D) polymorphism of angiotensinⅠ-converting enzyme gene (ACE) and esophageal carcinoma.Methods50 patients were enrolled in the study.Polymerase chain reaction (PCR) was served to detect insertion/deletion genotypes of ACE gene in tumor tissues and ACE expression in 10 samples of normal tissue in the same group were served as control.ResultsIn tumor tissue of esophageal carcinoma, the frequencies of genotypes of ID, DD and Ⅱ of ACE gene were 16%, 64% and 20%respectively, the I/D alleles were 20% and 80% respectively; in the control, the frequencies of genotypes of ID, DD and Ⅱ of ACE gene were 40%, 30%,30% respectively, I/D alleles were 30% and 70% respectively, the difference of DD genotype between two groups was signi fi cant (P＜0.05), however, the difference of I/D alleles was not signi fi cant(P＞0.05).ConclusionsThere was an (I/D) polymorphism of ACE gene in esophageal carcinoma patients, the different polymorphism of ACE gene might be correlated to the incidence of the disease.

Angiotensin Ⅰ-converting enzyme; Gene; Polymorphism; Esophageal carcinoma

R735.1

B

1671-8194（2012）16-0001-02

10.15912/j.cnki.gocm.2012.16.281

上海市浦东新区科技基金项目(编号:PW2009A-19)