肖光文，刘良专，徐 磊，谢小平，3，吴移谋

肺炎嗜衣原体（Chlamydophilapneumoniae，Cpn）除引起呼吸道疾病外，还与一些其他疾病如结节性红斑、Guillian－Barré综合征、结节病、反应性关节炎［1］以及慢性动脉粥样硬化［2－3］等疾病有关。Cpn致病机制的研究多年来一直是衣原体研究的热点之一。

有研究证实，在Cpn中存在独立的能分泌毒力因子的细胞器［4］——III型分泌系统（Type III se－cretion system，T3SS）。T3SS由30～40kbp基因编码，以毒力岛的形式存在于细菌的质粒或染色体上，其主要作用是通过接触依赖性转运机制将效应蛋白转入宿主细胞（真核细胞）中，从而影响宿主细胞的正常新陈代谢及其功能［5］。

Robert等用非线性pH3－10的预制金条进行二维电泳证实了Cpn0425存在于Cpn蛋白簇中。其基因由588个碱基构成，分子量大约为21．3kD，目前功能不明。许多研究者认为编码T3SS效应蛋白的基因通常位于其伴侣蛋白的附近［6］，Cpn0425位于编码T3SS的基因族内，因此将其预测为CpnT3SS的一个效应蛋白。本研究主要通过从Gen－Bank中得到Cpn0425编码基因的碱基序列，对照pGEX6p－2载体上的多克隆酶切位点，设计一对特异性扩增引物。对该蛋白进行体外的克隆表达及纯化，为CpnT3SS效应蛋白的筛选与鉴定及其致病作用的研究奠定基础。

1 材料与方法

1．1 菌株、重组质粒和细胞株 pGEX6p－2质粒，E．coliBL21菌株：均为南华大学病原生物学研究所保存。

1．2 工具酶、分子量标准、试剂盒 Tag酶、T4连接酶、BamHⅠ、NotⅠ限制性内切酶购自美国Promega公司；次高分子量蛋白Marker购自北京MBI公司；1kbp和100bp DNA分子量标准购自美国MBI公司；AxyPrep PCR试剂盒购自Axygen公司；GST纯化树脂购自默克Novagen。

1．3Cpn0425基因的扩增Cpn0425基因全长序列通过互联网从GenBank获得，对照pQE30载体上的多克隆酶切位点，采用Primer Premier 5．0软件设计Cpn0425基因的特异性扩增引物。分别在上游引物（P1）和下游引物（P2）中引入BamHⅠ酶切位点核苷酸G▼GATCC和NotI酶切位点核苷酸GC▼G G CCGC，同时加上保护性碱基。引物由武汉Invitrogen公司合成，上游引物：5′－CGC G▼GATCCATG AAT AAA AAG CCC AAG AAA AC－3′（下划线为BamHⅠ酶切位点），下游引物：5′－TTTTCCTTTT GC▼G G CCGC TTA CTC AGC GCC TTT AAC CAT －3′（下划线为NotⅠ酶切位点），以CpnAR－39标准株的基因组DNA为模板。用PyrbestTMDNA高保真聚合酶（TaKa－Ra公司产品）进行PCR。PCR反应体系：10×buffer（含 MgCl2）5μL、2．5mmol／LdNTP 4μL、50fmol／L 引物各0．5μL、PyrbestTMDNA polymerase（5U）0．25μL、DNA模板1μL，加水至总体积为50μL。扩增参数：混匀后点离，94℃预变性5min后，进入94℃变性30s，52℃退火45s，72℃延伸60s的循环，共计30次，末次循环后72℃延伸10min，终止反应。

1．4 pGEX6p－2／Cpn0425原核表达载体的构建采用Axygen公司的AxyPrep PCR试剂盒对PCR产物进行纯化，将纯化的PCR产物（Cpn0425基因）与克隆载体pGEX6p－2在T4DNA连接酶的作用下，16℃连接过夜，克隆重组体pGEX6p－2／Cpn0425转入感受态E．coliBL21，增菌后，氨苄青霉素和蓝白斑筛选阳性克隆，提取重组体质粒，PCR及BamHⅠ和NotⅠ（美国Promega公司）双酶切鉴定重组情况。

1．5 核苷酸序列测定 将连接成功的阳性克隆pGEX6p－2／Cpn0425菌液（E．coliBL21）送上海生工进行目的基因测序，序列测定结果与GenBank上发表的CpnAR－39Cpn0425序列进行Blast比较，以判断目的片段是否连接成功。

1．6Cpn0425在E．coli中的诱导表达及鉴定 取重组质粒pGEX6p－2／Cpn0425E．coliBL21转化菌10μL，将菌液加到LB固体培养基（含氨节青霉素）上，用接种环划平板，37℃培养14h，挑取1个阳性菌落，加入2mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃水浴振荡培养过夜；次日以1∶50的比例接种于5mL含氨苄青霉素的LB液体培养基，重组菌培养至OD值为0．6左右时，向培养物中加入IPTG至终浓度为0．2mmol／L，30℃分别诱导表达4h；取1．0mL菌液13 000r／min离心30s，收集菌体沉淀，分别用100μL 2×SDS凝胶加样缓冲液重悬，然后100℃水浴中加热5min，13 000r／min离心5min，留上清作SDS－PAGE分析。

1．7Cpn0425纯化 按照上述条件进行大规模诱导表达，10 000r／min离心20min收获菌体沉淀。PBS洗涤沉淀，重悬于PBS中（每克湿菌体加8mL PBS），并加入溶菌酶至4．0g／L；室温孵育2h，超声裂菌（10s／次，间歇10s；共计30次）。10 000r／min离心20min分别收集上清和沉淀。取超声裂菌上清，采用默克Novagen的GST纯化树脂按说明纯化pGEX6P－2／Cpn0425重组表达产物 GSTCpn0425，分别收集过柱液以及各段洗涤、洗脱液，取样进行SDS－PAGE电泳分析。合并洗脱液，用tris8．0将目的蛋白透析2～3次，换蒸馏水透析1～2次，再回收透析袋里的液体。

1．8Cpn0425蛋白的鉴定 纯化产物经SDS－PAGE电泳后转印硝酸纤维素膜，用TBST 1：200稀释的鼠抗CpnAR－39多克隆抗体为一抗，1∶5 000稀释的HRP标记的兔抗小鼠IgG为二抗进行Western－Blot鉴定，鉴定其抗原性。

2 结 果

2．1 pGEX6p－2／Cpn0425的 PCR 扩增 将 PCR扩增产物于1．0%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，在约590bp左右位置可见一条清晰的特异性条带（图1），与预期片段大小（588bp）相符。

图1 pGEX6p－2／Cpn0425质粒PCR鉴定Fig．1 PCR analysis of pGEX6p－2／Cpn0425plasmidM：DNA marker；1：PCR product of PGEX6p－2／Cpn0425

2．2 pGEX6p－2／Cpn0425原核表达载体的构建及鉴定 构建的pGEX6p－2／Cpn0425重组质粒经BamHⅠ和NotⅠ双酶切，结果经1%琼脂糖凝胶电泳分析可见，酶切后出现了两个片段，大片段接近4 900bp，小片段约590bp左右与预期值（588bp）相符（图2）；初步证明Cpn0425目的基因成功地嵌入pGEX6p－2载体中。

图2 pGEX6p－2／Cpn0425质粒的双酶切鉴定Fig．2 Restriction enzyme digest analysis of pGEX6p－2／Cpn0425plasmid1：PGEX6p／Cpn0425plasmid digested by BamHI and XhoⅠ；2：PGEX6p／Cpn0425recombinant plasmid；M：15 000bp DNA marker

2．3 核苷酸序列分析Blast分析 将重组质粒进行序列测定，BLAST软件对测序结果与GenBank上登录的编码序列进行比对，结果表明扩增的Cpn0425目的基因序列与登录号为gi 15617929上基因完全一致，无碱基突变，且密码子读码框架正确。

pGEX6p－2／Cpn0425重组质粒的诱导表达与纯化及其鉴定 将pGEX6p－2／Cpn0425重组质粒转化至E．coliBl21表达宿主菌进行诱导表达。SDSPAGE结果显示：诱导菌在Mr约为50kDa处有明显条带，与预期的分子量相符。GST－Cpn0425重组蛋白上GST融合蛋白纯化柱，12%SDS－PAGE分析发现，缓冲液Ⅰ，Ⅱ，III洗脱下少量目的蛋白，洗脱液在相应位置最终收集得到纯化融合蛋白，其Mr约为50kDa。融合蛋白下可见一些条带，考虑为融合蛋白降解产物形成，见图3。

图3 GST－Cpn0425纯化的SDS－PAGE结果Fig．3 SDS－PAGE of purified GST－Cpn0425M：Protein marker；1：Precipitation of broken induced Bl21with pGEX6p－2／Cpn0425；2：Supernatant of broken induced Bl21with pGEX6p－2／Cpn0425；3：Flow－through；4－6：Washes；7－9：Eluates（Purified GST－Cpn0425）

2．4 GST－Cpn0425重组蛋白的 Western blot鉴定以鼠抗CpnAR－39多克隆抗体为一抗，Western blot检测诱导表达的GST－Cpn0425，结果表明在Mr约为50kDa处出现了明显的特异性反应条带，而未诱导的菌体无特异性条带出现，见图4。

图4 GST－Cpn0425的免疫印迹鉴定Fig．4 Western blot analysis of the GST－Cpn0425recombinant protein1：Induced Bl21with pGEX6p－2／Cpn0425；2：Noninduced Bl21with pGEX6p－2／Cpn0425；3：Purified GST－Cpn0425recombinant protein

3 讨 论

本研究选择的pGEX6p－2表达载体，是经pBR322质粒改造而来的一种原核表达载体，采用乳糖操纵子调控模式，启动子是Ptac，使mRNA转录水平提高，可以诱导外源基因在宿主菌中高效表达。它含有供目的基因插入的多克隆位点，并携带氨苄青霉素β－内酰胺酶抗性基因，有利于转化宿主菌后筛选阳性克隆；同时含有GST的编码序列，可使表达的外源重组蛋白融合入一个相对分子质量约26×103的GST纯化标签，该标签对表达蛋白的有效纯化和保持蛋白质的天然生物学活性作用重大。对GST融合蛋白采用默克Novagen的GST纯化树脂进行纯化，GST纯化填料的专一性非常高，只对GST及其融合蛋白具有吸附活性，有利于提高目标蛋白的纯度；同时利用GST与GSH的亲和作用来纯化蛋白，只有GST天然蛋白才具有该亲和特性，因此得到的纯化蛋白能够保持其天然的生物学活性。本研究中我们选择pGEX6p－2作为原核表达载体，高效表达了GST融合蛋白，有效纯化的GST融合蛋白不但纯度高而且具有天然生物学活性，为后续实验的准确性奠定良好的基础。

本研究选择的表达菌E．coliBL21是常用的表达菌株，一般配合以强表达载体pGEX载体来进行目的基因的强表达。由于BL21菌株缺失Lon和OmpT蛋白酶产物，这可以降低宿主细胞内蛋白酶降解的影响。此外还可以帮助提高完整可溶性蛋白的产率。为高效表达可溶性GST融合蛋白提供良好条件。

用PCR法从CpnAR－39基因组模板中扩增出目的片段，经测序证实与基因库登陆的核苷酸序列一致，将目的基因亚克隆到原核表达载体构建了表达重组体pGEX6p－2／Cpn0425，并成功转化至E．coliBL21。重组蛋白可以充分结合在默克Novagen的GST纯化树脂柱上，经纯化得到高纯度的目的蛋白。本研究还对重组融合蛋白进行了透析处理，蛋白透析可降低谷光甘肽（GST）的浓度，因而进一步优化了本研究的条件。此外，蛋白免疫印迹进一步分析了表达的重组蛋白及纯化蛋白的免疫特性，重组蛋白能与鼠抗CpnAR－39多克隆抗体发生反应，说明了目的蛋白能在大肠杆菌中表达，并具有很好的抗原性。

目前CpnT3SS效应蛋白的相关研究已成为国内外研究的热点，其效应蛋白的鉴定及致病作用的研究已经取得了一些成果，支持性的证据［4］包括与其它细菌T3SS效应蛋白有相似的直接序列或二级结构；与其它T3SS同源体接合或共沉淀；T3SS介导的分泌物的论证或目的效应蛋白通过一个替代宿主细菌T3SS分泌 。有资料表明，效应蛋白包含多种毒性效应，包括细胞骨架的改变、破坏信号转导途径和抑制凋亡活性以及干扰宿主转录调节等［7］。Cpn0425是一个目前尚未知功能的蛋白，其基因位于T3SS伴侣蛋白附近。研究其生物学作用及其在致病过程中的作用对了解其是否和Cpn致病有关及筛选、鉴定其是否属于CpnT3SS效应蛋白奠定基础。

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