宋仁刚

ANGPTL-1基因在老化鼠尾皮肤成纤维细胞中的表达及意义

宋仁刚

目的 体外研究鼠尾皮肤成纤维细胞（MTSF）发生老化时，ANGPTL－1中的表达及意义。方法 分别收集不同年龄原代鼠尾皮肤成纤维细胞，并检测老化细胞的COL1、COL3及透明质酸合成量。用RT-PCR检测两组细胞中ANGPTL－1基因及胶原蛋白与透明质酸含量。结果 ANGPTL－1基因在青年组鼠尾皮肤成纤维细胞中的表达明显高于老年组（P＜0.01）；老年组成纤维细胞COL1、COL3及透明质酸合成量显著低于青年组成纤维细胞（P<0.01）。结论ANGPTL－1基因可能是延缓鼠尾皮肤成纤维细胞老化的重要基因之一，可应用于皮肤抗衰老的研究。

血管生成素样蛋白 老化 皮肤成纤维细胞 胶原蛋白 透明质酸（HA）

皮肤组织会不可避免的出现老龄化变化。临床表现为皮肤失水，皱纹增加，皮肤松弛，弹性下降；组织学上表现为皮肤胶原纤维和弹性纤维断裂，透明质酸（hyaluronic acid，HA）含量减少。皮肤胶原蛋白及透明质酸由真皮层内的成纤维细胞的合成[1]。因此，探索皮肤衰老的相关因素，筛选相关基因，有望成为对抗皮肤老化的又一途径。

通过网络对基因数据库的搜索，我们筛选了出了血管生成素样蛋白（ANGPTL）-1基因。在老年组小鼠与青年组小鼠中，ANGPTL-1基因的表达存在显著性差异（P<0.01），而关于ANGPTL1基因与皮肤老化关系，目前仍缺乏相关研究报道。

1 材料和方法

1.1 成纤维细胞收集

分别选取5月龄和 30月龄的小鼠各10只，分别记为青年组与老年组。标本取自鼠尾的皮肤。收集皮肤标本，以0.25%DispaseⅡ于4℃下消化8～11 h，用眼科镊子掀去表皮，保留真皮组织，用PBS清洗3次，剪碎，加入0.1%复合胶原酶，37℃消化4 h，100目无过滤，收集滤液，离心 10 min（1 000 r/min），去上清，含10%胎牛血清（FBS）的DMEM重悬。备用。

1.2 RT-PCR检测

收集青年小鼠与老年小鼠尾部皮肤成纤维细胞，提取总RNA时根据指示使用TRIzol试剂盒（Invitrogen公司）。以MQ水作为空白对照，分别记录RNA浓度及A260 nm/A280 nm。用反转录酶（TaKaRa公司）分离RNA，转化为cDNA。目的基因在Pubmed中得到序列号，通过使用软件Primer Premier 5.0 设计 ANGPTL-1、COL1、COL3 和内参GAPDH的引物。然后使用PCR扩增的Taq酶试剂盒（TaKaRa公司）及引物（由生工合成）加至 25 μL体积进行反应。

1.3 ELISA分析测量透明质酸

收集各组分第7天的培养液进行COL1、COL3和HA的ELISA检测，ELISA试剂盒（R&D systems公司）。按说明书加标准品，绘制标准曲线。将阴性、阳性对照组和待检测样品，按设计孔位加入96孔板，100 μL/孔。按说明书操作，除空白组外均加入50 μL的检测缓冲液。混匀，37℃恒温孵育30 min。孵育之后弃液，用缓冲液冲洗4次，每孔加100 μL的有效酶。混匀后，加盖，37℃孵育30 min。然后，用冲洗缓冲液将检测板清洗4次，每孔加入100 μL酶作用物。避光室温孵育5 min，加入50 μL的反应终止溶液终止反应。15 min内，在405 nm波长下观察吸光率，测出HA的浓度。

1.4 统计分析

用SPSS 11.0统计软件，进行t检验，P<0.01被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络数据库中信息搜索结果

在青年组（n=10）小鼠皮肤细胞中，ANGPTL基因表达明显高于老年组（n=10）（P<0.01）（图1）。

图1 网络数据库中信息搜索结果Fig.1 The research results in net data base

2.2 RT-PCR检测

图2 RT-PCR检测Fig.2RT-PCR

如图2所示，1泳道为青年组小鼠 HA基因表达，2、6泳道为Marker，3泳道为青年组COL1表达，4泳道为老年组COL1表达，5泳道为老年组HA基因表达，7泳道为青年组COL3表达，8泳道为老年组COL3表达，9泳道为青年组ANGPTL－1基因表达，10泳道为老年组ANGPTL1基因表达。

RT-PCR结果显示，随着小鼠年龄的增加ANGPTL基因的表达逐渐降低。

2.3 透明质酸ELISA测量

培养至第7天的成纤维细胞培养液分析发现，伴随小鼠年龄的降低细胞合成的Ⅰ、Ⅲ型胶原（COL1、COL3）与 HA 量均有增加的趋势（P<0.05）。ELISA测定透明质酸功能变化结果显示，其合成的胶原和透明质酸量也伴随ANGPTL－l基因的表达的降低而显著降低，并呈现出明显的相关性（图3）。

图3 ELISA测量Fig.3 ELISA

3 讨论

血管生成素样蛋白（ANGPTL）-1是血管生成素相关蛋白家族的成员，具有调制血管生成的作用。

透明质酸与胶原蛋白是人体真皮组织中的重要组成部分，随着紫外线的不断照射以及人年龄的增加，皮肤内透明质酸与胶原蛋白的含量逐渐减低，真皮组织被氧化、皮肤塌陷、萎缩。皮肤在外观上表现为粗糙、干燥、皱纹增大、松弛等一系列衰老征象。

近年来，在关于皮肤发生老化的研究中，皮肤成纤维细胞已经成为研究重点[2]，研究内容包括老化时细胞的基因[3-4]，受体改变[5]，相关信号传导通路的变化等领域[6-7]。

RT-PCR结果显示，随着小鼠年龄的增加ANGPTL－l基因的表达逐渐降低。ELISA测定透明质酸功能变化结果显示，其合成的胶原和透明质酸量也伴随ANGPTL基因的表达的降低而显著降低，并呈现出明显的相关性。

本实验结果提示，ANGPTL-1基因可能是延缓鼠尾皮肤成纤维细胞老化的重要基因之一，可应用于皮肤抗衰老的研究。然而，ANGPTL-1基因通过何种机制参与皮肤老化的调控，尚需进行深入研究。

[1]Rock K,Grandoch M,Majora M,et al Collagen fragments inhibit hyaluronan synthesis in skin fibroblasts in response to ultraviolet B(UVB):new insights into mechanisms of matrix remodeling[J].J Biol Chem,2011,286(20):18268-18276.

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The Expression and Meaning of ANGPTL1 Gene in Skin Fibroblast of Aging Mouse Tail

SONG Rengang.Department of Plastic Surgery,Shenzhen People's Hospital,Shenzhen 518020,China.

ObjectiveTo explore the expression of ANGPTL－1 gene,collagen and hyaluronic acid(HA)in skin fibroblast of aging mouse tail in vitro.MethodsPrimary mouse skin fibroblasts were collected in young and old mouse group.RTPCR was used to measure expression of collagen and hyaluronic acid.ResultsRT-PCR assay showed that the express of ANGPTL1 is higher in young group than in loder group.There was significant differene between 2 groups (P<0.01).ConclusionANGPTL－1 may be used as an effective factor to delay skin aging.

ANGPTL－1;Aging;Fibroblast;Collagen;Hyaluronic acid(HA)

Q786

A

1673－0364（2012）05－0269－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2012.05.006

518020 广东省深圳市 深圳市人民医院整形外科。

2012年8月12日；

2012年9月20日）