金华，邹吉祥，朴仁哲，郭鹏，吴凡，姜国斌

（1.大连民族学院环境与资源学院，辽宁大连 116605; 2.延边大学农学院，吉林延吉 133000）

金针菇rDNA－ITS序列分析

金华1，邹吉祥2，朴仁哲2，郭鹏1，吴凡1，姜国斌1

（1.大连民族学院环境与资源学院，辽宁大连 116605; 2.延边大学农学院，吉林延吉 133000）

为研究金针菇rDNA－ITS序列特征，提取了不同来源金针菇子实体的基因组DNA，对其rDNA的内转录间隔区进行PCR扩增和序列测定，并提交NCBI获得登录号;将不同产地的金针菇ITS序列与本研究获得的金针菇ITS序列进行对比分析，利用ITS序列分析技术研究其遗传多样性，并构建了NJ系统发育树。结果表明，所有供试材料的ITS全长在710～719 bp范围内，G+C含量在49.3%～49.9%，所有序列共有34个变异位点，16个信息位点，ITS区遗传距离变化范围为0～0.016，即不同产地的金针菇ITS序列在进化过程中存在差异。此结果可为真菌分类鉴定等研究提供重要的资料和依据。

金针菇;ITS序列;系统发育

金针菇（Flammulina velutipes）别名又称毛柄小火菇、构菌、朴菇、冬菇、朴菰、冻菌、金菇、智力菇等，属伞菌目白蘑科金钱菌属。“金针菇”、“银针菇”为真菌植物门真菌毛柄金钱菌的子实体。目前栽培的金针菇菌株中，有表现野生型的黄褐色菌株、突变的纯白菌株和一系列中间颜色的浅黄菌株［1］，金针菇菌盖滑嫩、菌柄细长脆嫩、形美、味鲜，是世界上著名的食、药两用菌和观赏菌，有广阔的开发前景［2－3］。金针菇在自然界广为分布，中国、日本、俄罗斯、欧洲、北美洲、澳大利亚等地均有分布。在中国北起黑龙江，南至云南，东起江苏，西至新疆均适合金针菇的生长。ITS序列在物种属内、近缘属间乃至科内系统进化关系研究中有一定的价值。真菌核糖体基因由小的亚单元（18S）、ITS1区、5.8s区、ITS2区和大的亚单元（28s）构成，头尾串联形成重复序列，一个基因组内有20～60个拷贝。真菌ITS区域长度一般在650～750 bp。ITS适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析［4］。核rDNA－ITS分子序列的进化较稳定、独立，变异较丰富，序列分析受主观因素的影响也较小。ITS片段在进化过程中承受的自然选择压力非常小，因此能够容纳更多的变异。由于ITS的序列分析能实质性地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异，而且ITS序列片段较小，易于分析，已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究中。

目前国内外对金针菇ITS序列研究报道较少，本研究通过对辽宁省大连市和沈阳市两个地区的金针菇样品进行ITS序列分析，并与在Gen-Bank中的其他金针菇ITS序列进行比较，分析不同产地金针菇的亲缘关系，以期为金针菇属的分子鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

2种金针菇分别来自辽宁省的大连市和沈阳市，子实体均为纯白色，是两地的主栽品种。将大连市金针菇ITS序列提交NCBI，并获得登录号;沈阳市金针菇ITS序列如下;另有8种金针菇的ITS序列来自GenBank。供试材料编号及产地见表1。

沈阳市金针菇ITS序列为:

表1 供试材料编号及产地

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

采用SDS法配合微型电钻研磨法［5］提取金针菇DNA。将提取的DNA用0.8%凝胶电泳检测后置于－20℃冰箱中保存备用。

1.2.2 PCR扩增ITS区段

采用金针菇ITS序列的通用引物ITS1（5'—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3'）和ITS4（5'—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3'）对样本进行扩增，引物由上海生物工程公司合成。

25 μL PCR反应体系:2.5 μL 10×PCR buffer （Mg2+）2.5 mmol·L－1、2 μL dNTP 2.5 mmol· L－1，引物分别加入0.5 μL（10 μL·L－1）、0.5 μL Taq DNA聚合酶（5U·μL－1）、0.5 μL DNA模板，用水补至25 μL。PCR扩增条件:94℃预变性2 min，94℃变性40 s，52℃复性1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃保温5 min，4℃保存。将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3 ITS测序分析及系统发育树构建

将扩增出的核酸片段在上海生物工程公司纯化后测序。将测序结果通过BLAST工具和DNAMAN软件配合手动排序、G+C含量和变异位点分析，获得的序列使用ClustalVersion2.1进行比对，选择一条序列作为代表序列，并在GenBank注册，所得序列号见表1。利用MEGA 5.0软件进行系统发育分析比对，并以自展法（bootstrap）进行检测，共循环1 000次，采用邻接法构建系统发育树（Neighbor joining tree）。使用MEGA5.0中的Maximum Composite Likelihood模型构建序列遗传距离矩阵。

2 结果与讨论

2.1 ITS序列长度与G+C含量分析

所有供试材料ITS总长度在710～719 bp（见表1），G+C质量分数为49.3%～49.9%。其中ITS1在242～249 bp，G+C质量分数为46.2%～48.3%;ITS2在308～311 bp，G+C质量分数为52.1%～53.6%。所有材料5.8 s长度均为159 bp，且G+C质量分数均为46.5%，说明5.8 s rDNA进化过程中高度保守［4，6－8］。分析表明，ITS2大于ITS1的长度，金针菇ITS区G+C质量分数变化较小，总体上ITS2序列的G+C质量分数高于ITS1。

2.2 ITS排序及序列位点的分析

通过Clustalx1.83对序列进行排序，所有序列共有34个位点发生变异，其中可用于分析的信息位点16个，ITS1区有6个，ITS2区有10个（见表2）。

表2 供试材料ITS的变异信息位点

碱基变异类型有C—T和G—A转换、C—G和T—G颠换、缺失变异。T→C转换8个，占50%;A→G转换1个，占6.3%;C→G颠换2个，占12.5%;T→G颠换1个，占6.5%;9个缺失位点，占56.3%，说明碱基变异类型主要以缺失和转换为主。ITS区共有变异位点34个;信息位点16个，占总变异位点的47.06%。其中ITS1有22个变异位点，6个变异信息位点，占总变异位点的27.27%;ITS2有12个变异位点，10个变异信息位点，占总变异位点的83.33%。ITS1变异位点数量高于ITS2，但ITS2的变异信息位点数明显高于ITS1。

2.3 金针菇ITS序列遗传距离分析

采用MEGA5.0根据Maximum Composite Likelihood参数分析得到序列间遗传距离（见表3）。10种金针菇样品的平均距离为0.008。遗传距离最大为0.016，样品1、样品2、样品8、样品10的遗传距离最小，为0.000，说明它们的ITS序列为同源序列。样品5和样品6接近0.001，说明同源性很近。其余样品遗传距离均小于0.1，说明它们之间的遗传关系较近，其遗传分化可能发生很晚或者种群间的基因流动发生频繁。

表3 基于rDNA－ITS序列的遗传距离比较

2.4 金针菇系统发育树构建

根据测序结果，利用MEGE 5.0软件构建NJ系统发育树（如图1），并用靴带自展法（bootstrap）检验发育树，重复1 000次，以判断各分支处的可信度。样品5、样品6自成一支，表明这2个样品极其相似，得到了bootstrap值的有力支持（99%），并且与其余8个样品处于树的两大分支上，说明与其他样品差异较大。而在其余9个样品中，样品4和样品7自成1支，表明这两个样品在ITS区极其相似，得到了bootstrap值的有力支持（84%）。

图1 基于ITS序列构建10种金针菇材料的NJ系统发育树

3 结语

本文从rDNA的ITS序列分析了不同产地金针菇的变异信息、遗传距离，以及系统发育树的构建，发现总变异位点数34个，占全序列的4.77%，信息位点16个，占2.24%，可见，金针菇ITS序列在进化过程中进化信息较为丰富。尽管各金针菇样品间亲缘关系较近，但仍能具体划分出各样品间的关系，说明ITS序列分析可作为一种用于真菌分类鉴定的分子标记方法。然而，个别真菌由于进化顺序、变异，甚至分析方法等原因，在间隔区表现的差异性比较小，各种类间ITS序列的分析还不明显，单纯依靠ITS序列并不能对金钱菌属种类进行有效的分类鉴定，因此需要结合其他的分子标记技术进行分类鉴定，以提高对真菌类分子鉴定的准确度和灵敏度，例如将其与分子信息学、形态学、生态学、生理学、生化学等结合进行综合分析，金针菇属亲缘关系的鉴定将会更准确、可靠和快速。

［1］蚁瑞荣，曹晖，潘迎捷.金针菇单核出菇与子实体颜色［J］.食用菌学报，2007，14（2）:33－36.

［2］于荣利，秦旭升，宋凤菊.金针菇研究概况［J］.食用菌学报，2004，11（4）:63－68.

［3］宋冬灵，曾宪贤，吕杰，等.金针菇遗传育种研究进展［J］.种子，2007，26（5）:52－54.

［4］陈剑山，郑服丛.ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用［J］.安徽农业科学，2007，35（13）:3785－3786.

［5］王雅玲，吕国忠，柴同杰，等.气载镰孢菌的RAPD分子特性研究［J］.家畜生态学报，2008，29（1）:38－42.

［6］刘娜娜.黄杨属部分植物nrDNAITS序列测定及亲缘关系分析［D］.南京:南京林业大学，2010.

［7］陈凤毛.真菌ITS区序列结构及其应用［J］.林业科技开发，2007，21（2）:5－7.

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Sequence Analysis of rDNA－ITS of Flammulina Velutipes

JIN Hua1，ZOU Ji－xiang2，PIAO Ren－zhe2，GUO Peng1，WU Fan1，JIANG Guo－bin1
（1.College of Enviroment Science and Engineering，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China;2.College of Agriculture，Yanbian University，Yanji Jilin 133000，China）

To study the characteristics of the sequences of internal transcribed spacer of ribosomal DNA from Flammulina velutipes，the genomic DNA in the fruiting bodies of Flammulina velutipes from different origins were extracted.The internal transcribed spacer of DNA was amplified using PCR and ITS sequences were obtained.NCBI was submitted to the GenBank Databases of and registered number was obtained.The ITS sequences of Flammulina velutipes in this research were compared with those of different habitats relatives downloaded from GenBank by MEGA，BLAST，DNAMAN and Clustalx programs.Their genetic diversities were studied by ITS sequences analysis technology.Based on DNA sequencing and alignment with GenBank，the phylogenetic tree was constructed by neighbor joining methods.The results show that all the materials’sequences of ITS are in the range from 710 to 719bp in size and G+C content is varied from 49.3%to 49.9%.There are 36 variable sites and 13 information sites in ITS.The range of genetic distances and genetic differentiation vary from 0 to0.016.This shows that sample of different habitats have some differences seen in the course of evolution.The results provide the important data and evidence for related fungus classify system.

Flammulina velutipes;internal transcribed spacer（ITS）sequence;phylogeny

S646.1

A

2011－12－15;最后

2012－03－15

中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（DC10040105）;吉林省科技厅项目（21200253）。

金华（1971－），女，朝鲜族，吉林延吉人，副教授，博士，主要从事植物分子分类及逆境植物生物学研究。

（责任编辑 邹永红）