刘书苑，陈 科，刘 敏，何红晖，谢艳红，谢晓云，莫朝晖

(中南大学湘雅三医院内分泌科，湖南长沙410013)

钨酸钠促进新生猪胰岛细胞体外增殖、分化及分泌功能

刘书苑#，陈 科，刘 敏，何红晖，谢艳红，谢晓云，莫朝晖*

(中南大学湘雅三医院内分泌科，湖南长沙410013)

目的 观察钨酸钠在体外对新生猪胰岛细胞增殖及功能活性的影响。方法 分离和纯化新生猪胰岛细胞后，与钨酸钠共育，隔天进行细胞计数、MTT实验，取最佳浓度300 μmol/L钨酸钠与细胞共同培养3d，收集细胞进行葡萄糖刺激实验，并分别用Western blot、RT-PCR方法检测细胞内胰岛素蛋白(INSULIN)、细胞增殖核抗原(PCNA)和胰十二指肠同源框蛋-1(PDX-1)mRNA、葡萄糖转运子-2(GLUT-2)mRNA的表达。结果 300 μmol/L钨酸钠处理后胰岛细胞增殖活性及葡萄糖刺激实验中胰岛素分泌明显高于对照组(P＜0.05)，钨酸钠干预组PCNA蛋白和INSULIN蛋白表达分别为2.24±0.19和1.62±0.17，显著高于对照组的1.17±0.13和0.37±0.08(P＜0.05，P＜0.01);PDX-1和GLUT-2mRNA表达分别为0.34±0.05和1.06±0.10，显著高于对照组的0.11±0.03和0.13±0.02(P＜0.01)。结论 低浓度(300 μmol/L)钨酸钠具有促进新生猪胰岛细胞增殖分化、增强胰岛细胞功能、促进胰岛素分泌的作用。

钨酸钠;新生猪胰岛细胞;增殖和分化;胰岛功能

钨酸钠含有微量元素钨，具有很强的降糖作用，可将1型及2型糖尿病动物模型的血糖降至正常水平而不引起低血糖［1-2］。尽管钨酸钠与钒酸钠的生物学性质相似，毒性却明显较钒酸钠低，具有相对较高的生物利用度，这使得它在糖尿病防治方面较其他微量元素更具前景性。近年来发现其作用机制与钒酸钠有所差异，除具有类胰岛素作用外，还具有促进胰岛素分泌和促进胰岛细胞再生作用，因而即使撤药后相当长一段时间，治疗组动物血糖水平仍保持正常或低于对照组［1，3］。但迄今所进行的研究都是在小动物，基本为鼠类，而且这方面的研究结果也有分歧。

由于新生猪胰岛具有较高的增殖及生长成熟的潜能，不仅能较容易地在体外大量培养，而且相对于胎猪胰岛细胞具有对糖刺激的良好反应性，成为异种胰岛细胞移植最有前途的供体来源。但由于未成熟，移植后需要一段时间才能控制血糖，如何在体外培养过程中促进新生猪胰岛细胞增殖分化成熟与增强胰岛细胞功能，也被人们所关注。本研究探讨了钨酸钠降糖作用机制，也为改善新生猪胰岛细胞质量提高胰岛移植效果提供新的可能药物。

1 材料与方法

1.1 主要材料

Ⅴ型胶原酶(Sigma公司);真胰岛素检测试剂盒(北京泰格科信生物科技有限公司);RNA抽提试剂盒(Gentre公司);PCNA多克隆抗体(NO:13-3900)、Insulin蛋白多克隆抗体(Zeymed公司);辣根过氧化物酶标记抗鼠二抗、羊抗鼠actin、辣根过氧化物酶标记抗羊二抗、ECL(Santa Cruz公司)。

1.2 新生猪胰岛细胞的制备

出生3～5 d新生猪4头(湘雅医学院动物实验部，质量1.2～1.5 kg)氯胺酮麻醉后，无菌状态下剖腹取胰，去除肉眼所见的胰腺外组织、导管、结缔组织和淋巴组织、胰腺被膜后，将胰腺剪碎;加入0.5 g/L浓度的Ⅴ型胶原酶30 mL锥形瓶中37℃水浴剧烈振荡10 mm。用4℃ D-Hank's液中止消化。于4℃，1 000 r/min离心1 min，弃上清液，加入含20%小牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL、谷氨酰氨1%增补RPMI1640液，置放于37℃、5%CO2和95%空气的培养箱内培养，每个培养瓶内约1×105个细胞，实验备用。收集小部分胰岛细胞在倒置显微镜下观察细胞形态。双硫腙(DTZ)染色鉴定胰岛细胞纯度在80%以上，台盼蓝染色计数细胞存活率为95%。

1.3 不同浓度钨酸钠干预后胰岛细胞的生长曲线

配制2×104细胞悬液接种于 24孔板，每孔1 mL。分别于接种的第1、3、5和7天对钨酸钠浓度分别为 50、150、300、500 和700 μmol/L的 5 个实验组及对照组进行细胞计数并取平均值，作出细胞生长曲线。

根据此实验结果取300 μmol/L钨酸钠处理组为实验组进行以下实验。

1.4 MTT比色法检测细胞增殖活性

配制1×105/mL细胞悬液接种于96孔板，设实验组(300 μmol/L钨酸钠干预)和对照组各8个复孔，每孔200 μL细胞悬液，共接种4块板。分别于第1、3、5 和7 天取1 块96 孔板加入5 g/L MTT 20 μL，37℃培养箱孵育4 h后，弃上清液，每孔加150 μL DMSO振荡10 mm后，在全自动酶标仪上用550 nm波长比色，记录每孔A值并计算出每天各组的A均值，制表作图，批间变异系数8.1%，批内变异系数2.2%。

1.5 葡萄糖刺激实验

300 μmol/L浓度钨酸钠干预3 d后实验组和对照组用D-Hank's液洗涤后，均分成5份。分别先后用Hanks液配制的含2.7 mmol/L的低糖培养基和26.7 mmol/L的高糖培养基置换原培养基后孵育4 h，收集上清液，检测真胰岛素含量，批间变异系数12.1%，批内变异系数3.2%，并计算胰岛素刺激指数。

1.6 RT-PCR检测胰岛细胞PDX-1 mRNA、GLUT-2 mRNA

干预3 d后分别收集实验组和对照组胰岛细胞按Gentre RNA试剂盒抽提细胞总 RNA，取1 μg总RNA以Oligo(DT)18为引物进行反转录，反转录体系20 μL，将反转录的产物用于PCR扩增，引物设计见表1。PCR反应按以下条件进行:94℃预变性2.5 min，94℃变性30 s，PDX-1按52℃复性30 s;GLUT-2按58℃复性30 s;72℃延伸1 min。共扩增34个循环，2%的琼脂糖凝胶电泳PCR产物，凝胶成像系统显影拍照，Gene Tool分析软件测定吸光度值，并计算目的基因与β-actin吸光度比值。

表1 目的基因引物序列及扩增产物Table 1 Target gene's primer sequences and amplif ied product

1.7 Western bolt印迹检测PCNA、INSULIN蛋白

用细胞裂解缓冲液(50 mmol/L Tris-Hcl(pH 8.0)，150 mmol/L nacl，1% Triton X-100，0.2%NaN3，0.5% 去氧胆酸钠，10 mg/L Aprotinnin，1 mg/L PMSF)裂解细胞，抽提钨酸钠干预和对照组新生猪胰岛样细胞总蛋白。Bradford法测蛋白含量后，置 -70℃冰箱保存。取40 μg细胞总蛋白于10%SDS-PAGE胶中电泳，电转移至PVDF膜上。含5%脱脂奶粉的PBS封闭1 h，用鼠抗PCNA多克隆抗体(1∶500稀释)的 PBS，4℃温育过夜，PBS洗膜5 min×3次，用辣根过氧化物酶标记抗鼠二抗(1∶2 000稀释)的 PBS温育1 h，洗膜后，ECL 发光自显影，洗片显带。同膜洗脱后，用羊抗鼠 actin(1∶1 000稀释)一抗，辣根过氧化物酶标记抗羊二抗(1∶2 000稀释)重新杂膜，发光自显影，洗片显带作为内对照。所有杂交信号在成像分析仪系统测定条带密度。目的条带水平以PCNA/actin的比值表示。同法检测Insulin蛋白。

1.8 统计学分析

各实验独立重复3次以上。实验数据采用均数±标准差(±s)表示，统计学处理采用SPSS 11.0统计软件。两样本均数比较采用两独立样本t检验，组间比较用方差分析。计数资料采用卡方检验。

2 结果

2.1 新生猪胰岛细胞

刚分离的新生猪胰岛细胞团呈橘黄色半透明，与散在的胰岛细胞一起悬浮于培养基中(图1A)。培养5 d后，胰岛细胞呈类圆形细胞，胞质丰富，边缘清晰，有的细胞团边缘有一紫色弧形反光带，部分细胞团已开始铺散开贴壁，部分仍为细胞团，还有大量单个细胞贴壁或悬浮，可见成纤维细胞明显较前减少，细胞生长良好(图1B)。

图1 细胞接种第1天及第5天高倍镜下表现Fig 1 The performance of high－powered microscope in the first and the fifth day of cell culture

表2 不同浓度钨酸钠实验组及对照组培养7天细胞计数结果Table 2 The cells count results of test and control groups treated by different concentration sodium tungstate(±s，×104，n=4)

表2 不同浓度钨酸钠实验组及对照组培养7天细胞计数结果Table 2 The cells count results of test and control groups treated by different concentration sodium tungstate(±s，×104，n=4)

＊P ＜0.01 compared with control group.

group(μmol/L)day 1 day 3 day 5 day 7 control 2.00±0.00 3.00±0.33 6.00±1.03 7.33±0.65 50 2.00±0.00 3.63±0.42* 8.00±0.81* 9.63±0.98*150 2.00±0.00 3.75±0.43* 10.38±1.05* 11.00±1.00*300 2.00±0.00 4.38±0.51* 11.50±0.88* 12.13±1.03*500 2.00±0.00 4.88±0.42* 6.88±0.34* 8.13±0.88*700 2.00±0.00 4.50±0.35* 6.00±0.41* 6.13±0.68*

表3 钨酸钠干预实验组与对照组吸光度值结果Table 3 The absorption results of test and control groups treated by sodium tungstate(±s，A value，n=8)

表3 钨酸钠干预实验组与对照组吸光度值结果Table 3 The absorption results of test and control groups treated by sodium tungstate(±s，A value，n=8)

＊P ＜0.01 compared with control group.

group day 1 day 3 day 5 day 7 control 0.256±0.007 0.481±0.021 0.840±0.0520.895±0.043 test 0.254±0.112 0.594±0.074* 1.173±0.024* 1.205±0.062*

2.2 不同浓度钨酸钠对胰岛细胞生长的影响

细胞在培养第3～5天细胞数增长最快，随后进入平台期。浓度在50～500 μmol/L的钨酸钠处理组细胞数增加较明显，而浓度增高至700 μmol/L时胰岛细胞增长反而受抑制(表2)。

2.3 钨酸钠对胰岛细胞增殖活性的影响

随着培养时间的增加，以第3～5天时实验组细胞增殖最明显(P＜0.01)(表3)。

2.4 胰岛β细胞功能的葡萄糖刺激实验

在高糖或低糖刺激时，钨酸钠干预组胰岛素分泌水平及胰岛素刺激指数(ISI)均较对照组显著增高(P＜0.05)(表4)，提示钨酸钠增强新生猪胰岛细胞功能，促进胰岛素分泌。

表4 实验组与对照组葡萄糖刺激实验结果Table 4 The glucose stimulation test results of test and control group(μU/mL)

2.5 钨酸钠上调PCNA、细胞内胰岛素蛋白的表达

钨酸钠处理3 d后，PCNA蛋白及Insulin蛋白表达分别为2.24±0.19和1.62±0.17，显著高于对照组的1.17±0.13和0.37±0.08(P＜0.01)(图2)。

图2 钨酸钠干预对新生猪胰岛细胞PCNA、insulin蛋白表达的影响Fig 2 The PCNA and insulin protein expression after neonatal porcine islets treated by sodium tungstate

2.6 胰岛细胞PDX-1、GLUT-2基因的mRNA表达

钨酸钠干预组PDX-1mRNA和GLUT-2mRNA分别为0.34±0.05和1.06±0.10，显著高于对照组的0.11±0.03和0.13±0.02(P＜0.01)(图3)。

图3 经钨酸钠300μmol/L干预后实验组PDX-1、GLUT-2基因的mRNA表达Fig 3 The PDX-1 and GLUT-2 mRNA expression after test and control groups were treated by 300 μmol/L sodium tungstate

3 讨论

钨酸钠的降糖作用分别在1型、2型糖尿病动物实验中已得到证实，无论短期或长期用药，还是撤药后相当长一段时间均有显著效果［1，3-4］，此外还有降血脂的作用，且无明显肝肾毒副反应［4］，因而被认为可能是一种很有潜力的新型降糖药物。其降糖机制除与钒酸盐相似的类胰岛素作用外，还可能与其具有促胰岛素分泌和胰岛细胞再生作用有关［2，5-6］。

钨酸钠促进糖尿病动物模型的基础及葡萄糖刺激后血清胰岛素的水平升高［5］，在体外也促进胰岛素分泌、细胞内胰岛素含量增多及对葡萄糖刺激的高敏性［7］且胰岛素mRNA表达翻倍。但迄今为止所有实验模型基本局限在鼠类，本实验在新生猪胰岛细胞中观察到类似作用。

新生猪胰岛作为主要的异种胰岛移植细胞，具有较高的增殖及分化成熟的潜能［8］，除了分裂增殖外，还能从胰腺导管细胞分化而来。钨酸钠在一定浓度内有促进新生猪胰岛细胞生长的作用，高浓度抑制，这与钨酸盐、钒酸盐、钼酸盐对BRIN-BD11细胞影响相似［7］。在糖尿病鼠胰岛及生殖细胞上也有类似结果［1，6，9］。PDX-1 的功能主要是调控胰腺的分化发育、促进胰岛细胞再生及胰岛素基因的转录。在STZ糖尿病新生鼠胰岛中，观察到钨酸钠促进胰岛细胞分化成熟，且PDX-1的磷酸化形式比例明显增高。本实验也观察到钨酸钠上调新生猪胰岛细胞PDX-1mRNA表达，提示除了自身分裂增殖外，上调PDX-1mRNA表达或促进PDX-1磷酸化增强导管细胞分化再生也可能是钨酸钠促进β细胞增殖的机制之一，可能通过P38活化促进PDX-1磷酸化［10］，也可能通过直接增强P42/P44磷酸化、激活MAPK通路促进β细胞增殖［2］。

钨酸钠可改善胰岛细胞功能及活性，但其作用机制尚不明确。本实验首次观察到钨酸钠上调β细胞GLUT-2mRNA的表达，也能通过ERK1/2途径促进GLUT-4的合成和作用［11］，D加速葡萄糖转运，钨酸钠可激活细胞内腺苷酸环化酶及磷酸肌醇的活性，也可能通过关闭K+-ATP通道发挥促胰岛素分泌作用［12］，降低肠道上皮黏膜蔗糖酶及SGLT1的活性，减少高血糖对胰岛细胞、脑组织氧化应激损伤也可能是其降糖机制［4，13-14］。

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Sodium tungstate promotes the proliferation，differentiation and secretion of neonatal porcine islet cells in vitro

LIU Shu-yuan#，CHEN Ke，LIU Min，HE Hong-hui，XIE Yan-hong，XIE Xiao-yun，MO Zhao-hui*

(Dept.of Endocrinology，the Third Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410013，China)

ObjectiveTo investigate the possible mechanism of sodium tungstate in diabetic therapeutical effects and the protective function in neonatal porcine islet cellsin vitro，the effects of sodium tungstate on proliferation and differentiation of neonatal porcine islet cells was observedin vitroin our experiment.MethodsNeonatal porcine islets(NPIS)were cultured with various concentrations of sodium tungstate and carry out cell counting and MTT assay every other day.NPIS was exposed to the most proper concentration 300 μmol/L sodium tungstate for three days，and the glucose-stimulated insulin secrtion(GSIS)were detected，the expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)，insulin content in islet cells andPDX-1mRNA，GLUT-2mRNA were assayed by Western blot and RT-PCR respectively.ResultsThe group of islet cells were cultured with the dose of 300 μmol/L had the higher light absorption in MTT assay(P＜0.05)and GSIS was significantly increased in the group.The protein expressions of PCNA and INSULIN content in the experimental group were 2.24±0.19 and 1.62±0.17 significantly higher than that in control group which were 1.17±0.13 and 0.37±0.08(P＜0.05，P＜0.01).The mRNA expressions ofPDX-1andGLUT-2were 0.34±0.05 and 1.06±0.10 in the experimental group significantly higher than that in control group which were 0.11±0.03 and 0.13±0.02(P＜0.01).Conclusions 300μmol/L sodium tungstate has the advanced effect on promoting the proliferation and differentiation of neonatal porcine islet cell.It also has the effect in enhancing the function of insulin secretion.

sodium tungstate;neonatal porcine islet cell;proliferation and differentiation;the function of islet cell

R 335+.6

A

1001-6325(2012)09-1076-06

2010-11-01

2012-01-04

湖南省自然科学基金(06JJ5035)

*通信作者(corresponding author):MZH1964@126.COM#现工作单位:厦门大学附属中山医院内分泌科