韩鹏 梁媛媛 赵昱 刘阳 杨润琴 邓志宏

声带是发声的主要器官，其固有层的组织结构是正常发声的基础。手术、外伤、慢性炎症均有可能导致声带固有层损伤，造成细胞外基质成分的正常结构破坏，大量纤维组织增生、排列紊乱，从而产生瘢痕导致发声障碍。目前用于治疗声带损伤的方法主要为声带注射术，通过注射生物材料作为填充物，以减少声带瘢痕的形成，而术后对瘢痕愈合过程的观察多限于大体形态观察，包括损伤处局部有无充血、水肿、萎缩及瘢痕形成等。对声带细胞外基质成分的变化缺乏敏感指标，声带固有层细胞外基质(ECM)成分主要包括胶原纤维、弹力纤维、透明质酸和纤维连接蛋白(fibronectin)。胶原纤维起ECM的支架作用，声带损伤后其含量增加，呈粗而排列紊乱的纤维束；弹力纤维可以维持组织的弹力，损伤后其含量下降，排列紊乱；透明质酸影响声带的粘弹力，损伤后含量持续下降；纤维连接蛋白则是纤维化过程的前驱物质，损伤后含量持续增加[1～5]。因此，这些成分的变化可以在组织水平反应声带固有层损伤后的修复情况。

为更好的观察各种材料对声带损伤的修复作用，建立完善的声带损伤动物模型十分关键。目前常用的声带损伤动物模型有小鼠、大鼠、兔及犬模型等。因犬声带组织结构与人相近，是理想的实验动物[6,7]。声带手术导致的损伤常见的有激光造成的热损伤及手术器械造成的锐性损伤，半导体激光因其出血少等优点已广泛应用于嗓音外科[8～11]。因此，本实验选用犬为实验动物，模拟临床激光手术，在支撑喉镜下用半导体激光损伤双侧声带，观察术后声带愈合的大体形态及组织学变化，为下一步用干细胞修复声带损伤的实验提供基础。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康成年中华田园犬5只，体重10～15 kg，随机编为1、2、3、4、5号犬，1号为对照组，2～5号为实验组。实验动物由第四军医大学实验动物中心提供，实验期间在第四军医大学西京医院动物中心饲养。

1.2主要材料及器材 支撑喉镜(定制)，半导体激光仪(Leica)，冷光源(Olympus)，0o内镜(Stryker)，视频记录系统(Sony)，冰冻切片机(Leica)，抗Fibronectin抗体(1:100 abcam)，Masson三色染色、Elastin VG、爱先蓝染色套装(珠海贝索生物)。

1.3犬声带损伤模型建立方法 动物术前禁食12 小时，制动后称重，经后肢肌肉注射速眠新0.1 mg/kg，戊巴比妥钠0.2 mg/kg。麻醉后将动物固定于手术台，将2～5号犬在支撑喉镜下暴露双侧声带，局部喷少量利多卡因，半导体激光10 W点状损伤双侧声带膜部中后1/3段，面积约8 mm2，深达甲杓肌。术后3 d连续肌肉注射庆大霉素2 ml/只。1号犬不作任何处理，作为对照组。

1.4大体形态学及组织学观察 分别于术后4 d、2、4、8 w在支撑喉镜下观察声带创伤大体愈合情况后，各处死一只犬，于声带损伤处取材，一侧声带冰冻切片行免疫组化Fibronectin染色，另一侧石蜡切片行HE染色观察声带的炎症情况及Masson三色染色、Elastin VG染色、爱先蓝染色分别观察胶原、弹力纤维、透明质酸的变化。

1.5统计学方法 组织切片40倍显微镜下观察声带固有层结构，100倍显微镜下通过PhotoshopCS3软件对固有层细胞外基质成分进行全层量化数据分析，计算各个时间点声带固有层中胶原、弹力纤维、透明质酸及纤维连接蛋白的面积同固有层面积的百分比，每侧任意选3张切片行计量分析。

2 结果

2.1术后犬声带大体形态变化 术后动物均健康存活，支撑喉镜下见正常声带表面呈白色，粘膜光滑。术后4 d(2号犬)双侧声带充血、水肿，处于急性炎症期；术后2 w(3号犬)双侧声带充血水肿减轻，表面覆有伪膜；4 w(4号犬)时损伤部位基本愈合，表面不规则且瘢痕形成，无明显水肿或萎缩；8 w(5号犬)时可见声带瘢痕，损伤局部萎缩(图1)。

2.2组织学变化

2.2.1HE染色结果 正常声带表面被覆复层扁平上皮，下为结缔组织构成的固有层，主要含有胶原纤维、弹力纤维、纤维连接蛋白及透明质酸。术后4 d，双侧声带损伤处未被上皮覆盖，局部大量炎性细胞浸润及血管形成；术后2 w受损部位已被上皮完全覆盖，炎性细胞较前减少；4 w时受损声带固有层被致密的纤维组织所替代，大量纤维组织无序排列；8 w时纤维组织有所增粗，排列紊乱，但局部无明显炎性细胞浸润。由于炎症反应，术后2 w开始固有层出现大量腺体增生，至8 w时腺体未减少(图2a～e)。

图1 支撑喉镜下所见正常、激光损伤即刻、损伤后各观察时间点犬声带形态

图2 声带组织HE染色及Masson三色染色图片

图3 声带组织EVG及爱先蓝染色图片

图4 免疫组化DAB显色图片(×100)

2.2.2特殊染色及免疫组化观察固有层ECM变化 Masson三色染色示胶原在正常声带内主要分布在固有层深层；2 w时胶原含量持续增加，胶原间夹杂大量腺体；4 w时胶原纤维呈条索状，排列紊乱，含量持续增加；8 w时胶原呈粗大条索状，分布紊乱，含量增加(图2f～i)。EVG染色示正常犬声带内弹力纤维主要分布在固有层中层；术后2 w时其含量减少，排列紊乱；4 w时含量持续降低，纤维束较细；8 w时含量趋于稳定，排列略显紊乱(图3a～d )。爱先蓝染色示透明质酸在正常声带内分布于固有层全层，术后2 w时含量降低，随后含量持续下降(图3e～h)。

免疫组化染色示纤维连接蛋白在正常犬声带内位于固有层全层，浅层含量略多。损伤后2 w至4 w，其含量持续增加，损伤后8 w时，含量略有上升(图4a～d )。损伤后各组动物声带固有层细胞外基质成分含量的变化见表1。因术后4 d时声带充血水肿明显，胶原纤维与肌组织结构混乱，各种ECM成分含量不易检测，故表1中无术后4 d的数据。

3 讨论

研究声带损伤的修复需要相应的声带损伤动物模型，既往有学者选用小鼠、大鼠、兔及犬模型等[12～15]，由于不同种属动物组织结构不同，获得的实验数据差异较大，小鼠和大鼠虽易饲养和实验操作，但其声带偏短不利于行声带注射术，且术后愈合情况不易观察；兔的声带虽较长，但由于解剖原因兔声带不易暴露，手术多采用喉裂开方式，创伤较大；犬易饲养，其声带组织结构与人类相近，较适合作为实验动物。因此，本实验选用犬为研究对象，模拟临床激光手术，建立了激光损伤犬双侧声带的动物模型。

表1 对照组及损伤后不同时间犬声带固有层中胶原、弹力纤维、透明质酸及纤维连接蛋白含量的变化(%)(n=1)

既往Tateya等[16]在内窥镜下用显微镊将大鼠声带固有层剥离，术后2、4及8 w分别观察声带固有层ECM的改变，结果显示随着时间的推移，术后声带中胶原纤维含量持续增加，透明质酸含量持续下降，纤维连接蛋白含量持续上升。Rousseau等[17]在内窥镜下用显微剪将犬声带固有层与肌层锐性分离，分别于术后2、6月时观察声带内胶原纤维、弹力纤维、透明质酸、纤维连接蛋白的含量，结果示术后2月时声带固有层胶原含量上升，弹力纤维含量下降，胶原纤维及透明质酸含量与对照组无明显差别，术后6月时胶原含量上升，弹力纤维含量下降，透明质酸含量与对照组无显著性差异。本研究结果显示，激光损伤犬声带后4 d时，声带表面充血水肿，胶原纤维与肌组织结构混乱，各种ECM成分不易检测，术后2 w时胶原纤维增生，固有层细胞合成大量ECM成分修复缺损，术后4～8 w时胶原含量增加，纤维连接蛋白含量略上升，此期瘢痕组织渐趋于成熟，与上述学者的研究结果基本相符。说明半导体激光损伤声带的效果与使用显微剪、显微镊损伤固有层的效果无明显差别，提示半导体激光热损伤是一种可行的建立声带损伤动物模型的方式。

综上所述，支撑喉镜下应用半导体激光造成犬声带膜部热损伤，损伤后声带固有层内大量纤维组织形成，胶原含量上升，弹力纤维含量降低，透明质酸含量降低，纤维连接蛋白含量上升，为研究声带损伤的修复提供了可靠的动物模型。

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